ANALISI DELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO

ANALISI DELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO

Le acque, tra cui fiumi, pozzi, bacini, e altre fonti di acque corrente, possono venire a contatto con sostanze nocive come i rifiuti causati dagli scarichi domestici e industriali. Oltretutto se gli impianti di depurazione non funzionano bene c'è la possibilità che queste acque contaminate vengano a contatto con le falde acquifere e di conseguenza causare effetti nocivi per la presenza di batteri patogeni.

Lo scopo della nostra prova è quello di trovare il grado di inquinamento dell'acqua del fiume Chioma (vicino Livorno), dovuto alla presenza di agenti patogeni, cioè sostanze che possono nuocere ala salute delle persone.

Le acque vengono prelevate utilizzando flaconi di vetro trasparente perfettamente puliti, asciutti e sterilizzati con tappo, che devono rimanere chiusi fino al momento del prelievo. Questi flaconi devono essere riempiti per tre quarti e immediatamente chiusi. Nel riempirli si deve mettere l'imboccatura contrariamente alla corrente dell'acqua e vanno poi trasportati in contenitori refrigerati a 4°C dove devono rimanere fino al momento delle analisi.

Le analisi vengono effettuate in un laboratorio dove si coltivano in appositi terreni i microrganismi di origine animale e umana contenuti nei campioni di acqua prelevati. Questi batteri sono detti indicatori batterici di inquinamento perché nel materiale fecale, oltre ai microrganismi patogeni ne sono contenuti molti altri non nocivi.

Per l'esame delle acque non seguiamo un metodo diretto: i microrganismi non patogeni si chiamano indicatori perché grazie ad essi può arrivare a dedurre la presenza di quelli pericolosi. Come indicatori si usano i batteri fecali che sono sempre presenti e abbondanti nelle feci e facilmente svelabili(E. Coli).

Gli enterobatteri sono dei microrganismi che vivono nell'intestino umano e sono molto numerosi. Sono associati a particolari caratteristiche antigeniche e biochimiche:

Sono i gram negativi

Possono essere mobili, cioè dotati di flagelli, o immobili

Sono aerobi o anaerobi facoltativi

Possono svilupparsi in normali terreni di coltura

Attraverso la fermentazione, in ambienti anaerobi, utilizzano il glucosio producendo acidi e gas.

Sono catalasi positivi e ossidasi negativi.

Vivono nell'intestino dell'uomo, ma spesso causano all'uomo vari tipi di infezioni gastrointestinali(Salmonella e Shigella).

Gli antigeni degli enterobatteri si possono suddividere in 4 categorie principali:

Antigeni O, somatici, sono quelli delle membrane esterne, responsabili dell'attività enterotossica dei bacilli gram negativi. Non si deteriorano fino a 100°C e non vengono distrutti né da alcool né da acidi deboli. La reazione con i sieri specifici determina la formazione di un agglutinato di cellule batteriche difficile da frammentare con l'agitazione.

Antigeni H, flagellari, sono presenti nei flagelli dei batteri mobili e sono di natura proteica, inattivati dal calore (60°C) da alcool e da acidi. A contatto con sieri specifici forma un agglutinato a fiocchi, facilmente frammentabile.

Antigeni K, o capsulari, circondano quelli somatici e sono di natura polisaccaridica termostabili fino a 100°C. La loro disposizione impedisce l'agglutinazione da parte dei sieri anti-O e anti-H. (Esempi: Salmonella e E. Coli)

Antigeni delle fimbrie sono agglutinati dai sieri specifici con un tipo di agglutinazione simile a quella degli antigeni H. A volte sono talmenente abbondanti che nascondono gli antigeni O e impediscono la reazione con i sieri specifici.

I caratteri biochimici possono essere divisi in 4 gruppi:

utilizzo di alcuni substrati come fonte di carbonio

presenza d enzimi

prodotti del metabolismo specifici

capacità di fermentare alcuni zuccheri

Nella ricerca degli indicatori di contaminazione fecale nel campione di acqua, per il conteggio MPN, le specie da cercare devono essere svelabili per almeno una caratteristica biochimica, come per esempio per l'Escherichia Coli l'utilizzo del lattosio per la produzione di gas.

Il conteggio MPN è un metodo statistico che consiste in una prova presuntiva che sarà seguita dalla prova di conferma.

Per prima cosa occorre standardizzare le condizioni di sviluppo, cioè bisogna fornire le medesime condizioni di crescita al variare delle condizioni di semina, potendo così risalire al numero più probabile di batteri presenti in 100ml di campione. Successivamente confronteremo i valori ottenuti con quelli di un' apposita tavola MPN in base al numero di tubi positivi per ciascuna serie inoculata con una data diluizione. Dal confronto questi valori con quelli della tabella si può poi stabilire se un campione di acqua è potabile o no, cioè determineremo se i valori del nostro campioni rientramno nei limiti che un' acqua potabile deve rientrare. Secondo la normativa il valore limite di coliformi fecali è 0, mentre per quelli totali è 5.

La prova presuntiva si effettua usando come terreno in fase liquida il brodo lattosato, contenente lattosio(usato dagli E.Coli per la fermentazione) e come campione da analizzare l'acqua del Chioma.

Lavorando sotto cappa, introduciamo:

10 ml di campione in 5 provette , con campanella di durham

10 ml di brodo lattosato 2X, cioè a doppia concentrazione

50 ml di campione in una beuta, già contente la campanella di durham e 50 ml di brodo 2X.

Dopo questa procedura, incubiamo tutto, cioè provette e beuta, a 37°C per 24/48 ore; se il campione risulterà positivo ai coliformi ci sarà un intorbidamento del liquido e la formazione di gas nella campanella di durham.

Successivamente all'incubazione prendiamo le provette e la beuta, confrontiamo le positività con i valori forniti dalla legge.

Nel nostro caso notiamo che la  positività (con intorbidamento e formazione di gas) si è verificata nella beuta e in 4 provette, il numero più probabile di coliformi presenti in 100ml di acqua è 16.

(VEDI ALLEGATO"TABELLA MPN")

In seguito la prova presuntiva dobbiamo confermare questi risultati con altre due prove:

Prova di conferma per i coliformi totali

Prova di conferma per i coliformi fecali

Per fare queste prove dobbiamo utilizzare le provette che sono risultate positive dalla prova presuntiva.

La conferma dei coli totali, richiede l'utilizzo di un terreno come il BBVB, cioè Brodo Bile Verde Brillante, che è un terreno selettivo che inibisce lo sviluppo di tutti i batteri tranne i Coli.

Inseriamo 10 ml, di terreno, in ognuna delle 5 provette a cui aggiungiamo anche 0.5ml della soluzione presa dalle provette e dalla beuta risultate positive nella prova presuntiva.

È un'operazione di trapianto, eseguita con delle micropipette e in ogni provetta dobbiamo inserire anche una campanella di durham.

Incubiamo le 5 provette per 24/48 ore a 37°C in termostato e , trascorso il tempo dell'incubazione, osserviamo quali provette sono risultate positive alla presenza di coliformi totali, data sempre dall'intorbidamento e dalla formazione di gas nella campanella.

Per i coliformi fecali usiamo un altro tipo di terreno, l'E.Coli Broth (EC Broth), che ha composizione simile al brodo lattosato.

Aggiungiamo ai 10ml di terreno, precedentemente inseriti nelle 5 provette(con campanella di durham) 0,5 ml della soluzione contenuta in ogni provetta positiva e nella beuta, sempre con micropipette sterili. Stavolta l'incubazione viene fatta per 24 ore a 44°C, temperatura alla quale riescono a svilupparsi solo i Coli fecali.

Anche questa volta osserviamo la positività delle provetta, data sempre dai soliti fattori(intorbidamento e gas). Nel nostro caso la prova di conferma ha evidenziato la positività di 5 provette su 5 nel caso dei coliformi totali e di 3 provette su 5 per quelli fecali.

Il prossimo passo è identificare i tipi di enterobatteri presenti nel campione.

L'esame microbiologico non è utile perchè i batteri presenti nel campione non possono essere distinti da altri batteri gram negativi e tanto meno possono essere distinti fra di loro,quindi assume molta importanza l'esecuzione dell'esame colturale.

Dato che molti dei campioni inviati per l'analisi contengono più specie batteriche, è opportuno usare terreni selettivi per facilitare l'isolamento delle varie specie di enterobatteri dagli altri microrganismi.

I terreni selettivi adatti all'isolamento contengono sostanze che inibiscono la crescita di gram positivi e di alcuni gram negativi che non appartengono agli enterobatteri.

I terreni selettivi che abbiamo utilizzato per questa prova sono:

Agar Mac Conkey

Agar eosina blu di metilene (EMB)

Agar Endo

Agar Salmonella Shigella (SS)

Agar enterico di Hektoen (HE)

L'agar Mac Conkey è un terreno solido differenziale per l'isolamento selettivo dei batteri gram negativi.

I sali biliari ed il cristalvioletto inibiscono la crescita dei gram positivi e di alcuni gram negativi esigenti, in questo terreno sono presenti lattosio, unico carboidrato, e il rosso neutro, come indicatore del ph.

Le colonie dei fermentanti in lattosio, con forte produzione di acido(E. Coli) assumono un colore rosso scuro e possono essere circondate da un alone di precipitazione dei sali biliari.

I non fermentanti in lattosio, come Salmonella e Shigella, si presentano trasparenti.

I deboli fermentanti formano colonie di colore rosa più o meno chiaro alla periferia e con il centro rosa.

L' agar eosina blu di metilene (EMB) è un terreno solido differenziale per l'isolamento dei batteri coliformi da campioni con flora batterica mista.

I coloranti di anilina, eosina e blu di metilene, inibiscono i batteri gram positivi ed i batteri gram negativi esigenti;inoltre si combinano a ph acido formando un precipitato e fungono cosi da indicatori della produzione di acido.

Anche in questo terreno l'unico carboidrato presente è il lattosio.

I forti fermentati in lattosio formano colonie con riflessi metallici e di colore verde nero.

I deboli fermentati producono colonie porpora e i non fermentati formano colonie trasparenti.

L'agar endo è un terreno solido impiegato per isolare i coliformi da alimenti come acqua, latte ed altri generi alimentari. Il solfito di sodio e la fucsina basica servono ad inibire la crescita dei batteri gram positivi.

Le colonie che fermentano il lattosio presentano un colore che va dal rosa al rosso. I forti produttori di acidi, come l'E. Coli, possono colorare il terreno intorno alle colonie,o produrre  una lucentezza metallica per reazione con la fucsina basica.

I microrganismi che non fermentano lattosio(Salmonella e Shigella) producono colonie che presentano quasi lo stesso colore del terreno.

Per la ricerca di salmonella e shigelle sono necessari terreni molto più selettivi come l'agar Salmonella Shigella (SS) e l'agar Hektoen enteric (HE)

L'agar SS è un terreno altamente selettivo che inibisce la crescita di tutti i batteri sia gram positivi che gram negativi e permette la crescita di Salmonella e Shigella.

Il lattosio è il carboidrato e il rosso neutro è l'indicatore per evidenziare la produzione di acido.

Differentemente dai terreni precedentemente descritti, contiene anche il triosolfato di sodio e citrato di ferro che rendono possibile la evidenziazione dei batteri produttori di H₂S secondo la seguente reazione:

Na₂SO₃ H₂S + Fe FeSO_{4 precipitato nero}

Il triosolfato di sodio venendo ridotto, in presenza di ferro, da luogo alla formazione di solfuro ferroso,di colore nero.

I batteri fermentati lattosio formano colonie di colore rosso;

La salmonella forma colonie incolori con centro nero più o meno evidente secondo la quantità di H₂S prodotto;le shigelle vengono variamente inibite e le colonie appaiono incolori senza centri neri.

L'agar Hektoen, come l'agar SS , contiene un elevata concentrazione di sali biliari cm sostanza inibitrice i gram positivi e i coliformi.

Però a differenza dell'agar SS contiene come carboidrati lattosio, saccarosio e salicina e , come indicatore di ph, il bleu di bromotimolo.

Per evidenziare l' H₂S, c'è il triosolfato di sodio e citrato di ferro.

I rapidi fermentanti sono moderatamente inibiti e producono colonie dall'arancio brillante al rosa salmone.

Le colonie di Salmonella appaiono blu verdi con centri neri dovuti all' H₂S.

Le shigelle appaiono più verdi delle Salmonelle con il colore che si attenua alla periferia della colonia.

Tutti questi terreni sono stati preparati rispettando le quantità di terreno in polvere ottenuta da una proporzione che ricaviamo leggendo le informazioni sulla confezione di ogni terreno.

Noi dobbiamo preparare circa 200 ml per ogni tipo di terreno,da inserire in 13 provette(15 ml di terreno per provetta).

Visto che questi terreni sono agar e quindi non si sciolgono molto bene in acqua, per cui vanno scaldati almeno fino a 80 gradi sul becco bunsen.

L'agar SS e l'agar Hektoen vanno preparati solo al momento del loro utilizzo.

L'operazione che segue è la semina che viene eseguita con la tecnica del triplo striscio, che permette di seminare una quantità sempre minore di campione e di ottenere uno sviluppo di colonie fra loro proporzionale.

Così facendo si ottengono colonie originatesi da una sola cellula, quindi, se il campione presenta più specie batteriche, si può ottenere una loro separazione. Le colonie sono infatti insiemi di milioni di cellule e si distinguono per la forma, le dimensioni ed il colore. 

La tecnica del triplo striscio permette di differenziare ed isolare maggiormente le colonie per evitare che si formi un "tappeto" di batteri che potrebbe coprire completamente, o quasi, la superficie della piastra, impedendoci i conteggio.

La semina nei terreni solidi avviene ovviamente sempre in condizioni sterili con questa procedura:

1. Impugniamo con una mano un ansa o un tampone  sterili e preleviamo una piccola quantità di campione, mentre con l'altra mano solleviamo il coperchio della piastra Petri.
2. Appoggiamo l'estremità con la quale abbiamo preso il campione.
3. Procediamo alla semina partendo dalla zona in cui si è deposto il campione e, continuando a zigzag(da un lato all'altro della piastra), si arriva circa fino e metà della piastra.
4. Cambiamo verso dello zigzag e raggiungiamo la metà della metà piastra rimasta vuota.
5. L'ultima metà della piastra la strisciamo riprendo il verso iniziale dello zigzag.

Dopo aver effettuato la semina dobbiamo incubare le piastre, che può avere tempo e temperatura diverse a seconda della specie di batteri da coltivare, ma che in genere è di 37° per 24-48 ore.

Particolarità di cui bisogna tener conto è che se il terreno solido è preparato con l'agar l'incubazione viene effettuata con le piastre Petri messe al contrario, cioè capovolte, per evitare che l'evaporazione dell'acuqa essicchi il terreno e la condensazione impedisca l'osservazione delle colonie.

Agar Mac Conkey:

sono presenti colonie di colore rossastro circondate da aloni chiari di precipitazioni dei sali biliari, dovute ai batteri fermentati il lattosio.

L'E. Coli è presente.

Agar eosina blu di metilene:

c'è la formazione di varie colonie con centro nero e una lucentezza metallica.

Notiamo anche colonie color porpora.

Sono presenti E. Coli e alcuni deboli fermentanti in lattosio.

Agar endo:

possiamo osservare la formazione di molte colonie di colore rosa-rosso che evidenziano la presenza di E.coli.

Agar Hektoen:

vediamo che si sono formate poche colonie con colorazione tra l'arancio e il rosa salmone mentre un' altra parte ha colorazione verde e sono più piccole.

Sono quindi presenti Escherichia Coli e forse anche alcuni non fermentanti il lattosio.

Agar SS:

In questo terreno si nota solo una colonia di colore rossorosa, ma non sono state evidenziate né la Salmonella né la Shigella, perché non sono presenti colonie incolori con centri neri.