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INGEGNERIA GENETICA - VETTORI DI CLONAGGIO, RT-PCR

INGEGNERIA GENETICA - VETTORI DI CLONAGGIO, RT-PCR
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Ingegneria genetica

Modificazione dell’ingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico.

 

                                                   Ricerca di base: purificare, esprimere, amplificare geni.

 Utilizzata   

                                          Ricerca applicata/commerciale (biotecnologie): sviluppo microrganismi

                                          ingegnerizzati per la produzione di specifiche sostanze (ormoni, vaccini,                                                  



                                          farmaci, proteine).

Per poter manipolare un gene è necessario CLONARLO: isolarlo, purificarlo e farlo esprimere (ovvero tradurlo in un sistema più comprensibile per l’operatore).

Gli strumenti dell’ingegneria genetica sono:

1.      Vettori di clonaggio (utilizzati per portare le sequenze di DNA in batteri ricettivi e per amplificare la sequenza desiderata) sono i plasmidi. Servono per inserire DNA esogeno al loro interno e al tempo stesso essere in grado di replicarsi nelcellula - METABOLISMO, LA RESPIRAZIONE, RESPIRAZIONE AEROBICA DELLA SOSTANZA ORGANICA" class="text">la cellula ospite.                                  

      I vettori plasmidici  sono pUC, pBR 322, pGEM e sono formatida circa 20 Kb;

      i batteriofagi, come lambda, costituiti da circa 25 Kb;

      cosmidici     costituiti fino a 45 Kb.

2.      Enzimi di restrizione servono per tagliare in modo riproducibile il DNA da amplificare in punti precisi allo scopo di inserirlo nei vettori (sono le endonucleasi di restrizione).

Riconoscono sequenze specifiche di DNA che sono rappresentate da 4-5 basi e tagliano solo quando ci sono questi indicatori. I siti di taglio sono specifici e si hanno solo in presenza di una sequenza 5 basi.

3.      DNA ligasi: è il processo inverso in grado di unire molecole lineari di DNA riformando l’unità della catena nucleotidica.

                                                   Vettori di clonaggio

§         Piccole, ben caratterizzate molecole di DNA;

§         Contengono almeno un sito d’inizio (ori) replicazione nell’ospite prescelto;

§         Contengono uno o più geni che ne consentano l’identificazione;

PLASMIDICI:

§         Replicano indipendentemente;

§         Piccole dimensioni;

§         DNA circolare (stabile durante la manipolazione);

§         Multiple copie per cellula;

§         Trasportano geni per la resistenza agli antibiotici;

§         Introdotti in batteri mediante trasformazione/elettroporazione (costosa, solo per alcuni batteri);

§         Rimosso operone tra;

§         Siti per azione endonucleasi di restrizione (siti di taglio per gli enzimi, detto sito di policlonaggio – multiple cloning site). Danno le estremità a cui far aderire il DNA da clonare.

Gli enzimi di restrizione (endonucleasi): riconoscono una sequenza sitospecifica nelle molecole di DNA se:

-         taglio sfalsato nella molecola di DNA generano estremità coesive (stikcy ends); è più facile 

      l’inserimento;

-         taglio non sfalsato nella doppia elica di DNA generano estremità piatte (blunt ends); non c’è 

      l’appaiamento delle basi e il plasmide non tende a richiudersi. L’opera delle ligasi è più  

      complicata.

Un gene non viene manipolato direttamente (per esempio un gene costituisce lo 0.05% del genoma E. coli), ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la quantità e facilitarne la manipolazione >>clonaggio.

1)      Isolamento e frammentazione DNA.

2)      Introdurre frammento desiderato.

3)      Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio.

4)      Identificare e purificare il clone desiderato.

5)      Produrre grandi quantità di gene clonato per studiarlo.

L’uso di enzimi di restrizione non è sufficiente per clonare un gene.

Quando le sticky o blunt ends create dagli enzimi di restrizione sono allineate  si formeranno solo  dei legami idrogeno tra le basi appaiate e non saranno sufficienti a mantenere l’integrità del DNA.

È necessario ricostruire la continuità dello scheletro della molecola di DNA utilizzando una DNA ligasi.

                                                                      

TRASFORMAZIONE E SELEZIONE     

Dopo aver ottenuto il DNA ricombinante, si amplifica introducendolo in un ospite adeguato: l’introduzione avviene mediante trasformazione in un ospite batterico (E. coli).

Poi si deve rendere le cellule competenti (mediante trattamento chimico o shock termico).

Problemi       → bassa efficienza

                      → falsi positivi: cellule trasformate da plasmidi circolarizzati ma senza inserto.

Selezionare cloni con frammento di DNA clonato utilizzando un marker che abbia una certa resistenza all’antibiotico.

CREAZIONE E SCREENING DI UNA LIBRERIA                                          

Abbiamo inserito un segmento di DNA in un vettore di clonaggio o espressore: abbiamo trasformato e piastrato dei batteri.

Come identifichiamo tra tutte le colonie ottenute quella che esprime il segmento di DNA (GENE) che ci interessa?

·        Ibridizzazione delle colonie con probe di DNA marcato con radioattivo (P32).

·        Screening immunologico per la proteina prodotta.

·        Screening enzimatico per l’attività della proteina.

STRATEGIA PER CLONARE SEGMENTO DNA DA CELLULA PROCARIOTICA

1)      Estrazione  DNA  > frammentazione  (digestione con specifici endonucleasi  di restrizione) >> identificare segmento di interesse >>> clonaggio.

2)      Frammentazione (digestione con specifici endonucleasi di restrizione) DNA >>clonare tutti i frammenti (libreria) >>> identificare il gene giusto.

3)      Sintetizzare il frammento di DNA desiderato (RT-PCR) > clonaggio nell’opportuno vettore.



STRATEGIA PER CLONARE SEQUENZA DI DNA DA CELLULA EUCARIOTICA

1)      I geni  delle cellule  eucariote contengono “esoni” (sequenze non codificanti di DNA) >> non è possibile clonare geni attraverso semplice digestione del DNA.

2)      Isolato mRNA di interesse > trasformato in dsDNA (cDNA) (transcriptasi inversa) >> amplificato con RT-PCR >>> clonato.


                                                                 RT-PCR

Ø      Possibilità di amplificare in vitro il numero di copie di una molecola di un segmento di DNA >

            Clonare – sequenziare – mutagenesi – diagnostica

Ø      Utilizza enzimi detti DNA –polimerasi che sintetizzano un frammento di  DNA  partendo da una regione a doppia elica (primer).

E. coli     37°C     con proof reading       (il primer si può attaccare dappertutto)

TAQ        72°C     senza  proof reading  (non è in grado di polimerizzare e poi di controllare se ha      

                                                                commesso errori)

Pfu        72/75°C   con proof reading       (polimerizza e controlla se ha sbagliato l’inserimento di

                                                                  nucleotidi) –ha un costo elevato-

Ciclo PCR :

-         denaturazione DNA a doppia elica (80°C): i ciclatori hanno sblocchi in cui avviene la

      denaturazione.

-         appaiamento  primer al template di DNA (40 – 70°C)

-         estensione ad opera della polimerasi (37°C)

Questo è un processo esponenziale per  cui il numero di copie del gene viene amplificata 2-4-8-l6-… in maniera progressiva. Viene copiata quella parte di DNA in cui la DNA polimerasi ha trovato l’innesco. Servono primer specifici per le varie regioni.

Il gene amplificato può essere introdotto direttamente in un vettore di clonaggio ed essere poi inserito nella fase successiva  di trasformazione e amplificazione. Viene evitato il processo di screening: siamo già partiti dal gene che ci interessava.

SCELTA DEI VETTORI DI CLONAGGIO

Un vettore di clonaggio è un elemento genetico al cui interno i geni possono essere ricombinati e replicati.

q       Plasmide optimum 10 Kb.

q       Per frammenti più larghi: batteriofago λ o cosmidi.

q       Per sequenziare: batteriofago M13 (E. coli e salmonella) è un virus batterico a singolo filamento che gli conferisce notevoli vantaggi per il sequenziamento.

q       Yeast artificial chromosome: vettori per lieviti 200-400 Kb.

q       Virali (per cellule eucariote): SV40; adenovirus; baculovirus (cellule insetto); retrovirus.

 

STRUTTURA DEL PLASMIDE Pbr322

q       Piccolo 4-3 Kb.

q       Stabile in E. coli.

q       Alto numero copie/cellule.

q       Facile da isolare.

q       Possibilità di inserire sino a 10 Kb.

q       Completamente sequenziato.

q       Singoli siti di clonaggio, ci sono i siti di taglio per enzimi diversi.

q       Geni per antibiotico resistenze: il plasmide presenta resistenza alle penicillina e alle tetracicline.

q       Facilmente trasformabile

q       Non c’è operone tra

CARATERISCTICHE PLASMIDE PER CLONARE DNA

1.      Piccole dimensioni;

2.      Singoli siti per endonucleasi di restrizione;

3.      Markers per identificare le cellule che contengono il contenuto.

COSMIDI

Vettori di clonaggio che possono clonare segmenti di DNA più larghi, fino a 40 Kb; e possono essere mantenuti sotto forma di plasmidi ( circolare), ma anche sotto forma di fagi. Si utilizzano solo le estremità della struttura  del batteriofago l. Sono delle estremità COS (nel genoma del fago l) e contengono dei segnali per l’impaccamento del DNA  nella testa del fago. Quando il materiale genico viene  introdotto in queste strutture viene replicato; tra un segmento e l’altro ci saranno le  sequenze COS che ne consentono l’introduzione nella testa del fago. Per cui vi saranno due estremità COS.

SCELTA DELL’OSPITE PER IL CLONAGGIO

 * Cellule  procariote     + facili da manipolare / poco costose / crescono rapidamente.

                                       

          E. coli                   - difficili trasformare (di solito si riesce ad eliminare) / potenzialmente   

                                          patogene / produce endotossine / ritiene proteine.

                          

         B. subtilis               - instabilità plasmidica / elimina DNA estraneo.

* Cellule eucariote           - facili da manipolare.

 

        S.cerevisiae è cellula di lievito che presenta una serie di problemi, cellule mammifero, cellule insetto.

VETTORI DI ESPRESSIONE

·        Vettori di clonaggio che contengono delle sequenze regolatorie per  garantire la  trascrizione e la traslazione (possibilmente in maniera regolata) di un gene.

·        Possono essere impiegati sia in cellule procariote che eucariote.

                     

Nella scelta del vettore da utilizzare si deve valutare:

1.      Numero copie vettore per cellula;

2.      Tipo promotore e sua attività / possibilità regolarlo;

3.      Segnali di inizio trascrizione;

4.      Stabilità peptidi prodotti.

PROMOTORE




* Requisito cruciale per il funzionamento di un sistema di espressione è la presenza di un forte e regolabile promotore. 

>>>regione (estremità 3’ di un gene) regola l’efficienza / frequenza con cui un gene viene trascritto (lega RNA - polimerasi) nei batteri è generalmente costituita da un promotore e da un operatore.

* * Problemi >> promotori di E. coli sono deboli

                           promotore di cellule eucariote forti non funziona in batteri

                           porre il gene sotto controllo promotore sempre attivo può essere negativo e può          

                           causare deficit energetici o tossica da accumulo .

promotore ideale  Õ  efficiente / attività regolabile dallo sperimentatore.

Lac

Tac

Trp

PL

Batteriofago T7 >> promotore fago T7 e fago T7 RNA polimerasi.

SEGNALI DI INIZIO TRASCRIZIONE

 

Nei procarioti  il ribosoma si lega ad una specifica sequenza ( Shine - Delgarno) seguita da uno start codon; c’è un’adeguata reading frame.

 

STABILITA’ PROTEINE SINTETIZZATE

 

·        Degradate;

·        Tossiche se si accumulano ne citoplasma;

·        Non vengono secrete.

Fondere una proteina con una CODA codificata dal vettore:

·        stabilizzi la proteina;

·        faciliti la purificazione;

·        segnale per secrezione.

PROBLEMI ASSOCIATI ALL’USO DI PROCARIOTI PER L’ESPRESSIONE DI PROTEINE DI ORIGINE EUCARIOTICA:

v     instabilità proteine sintetizzate/ difficoltà secrezione;

v     contaminanti potenzialmente pericolosi (tossici);

v     assenza di attività biologica Õ modificazioni post – translazionali cellule eucariote

                                                      + ponti disolfuro

                                                      + rimozione proteolitica di frammenti

                                                      + glicosilazione (O-linked ser/tre; N-linked aspar)

                                                      + modificazione di residui AA ( acetilazione/metilazione/

                                                          sulfatazione/fosforilazione)                          

Õ sistema espressione in cellule eucariotiche.

Questi sistemi necessiatno di:

§         promotore per cellule eucariotiche;

§         marker selezionabile;

§         sequenza che segnala poly A nell’mRNA formato;

§         sequenza di inserzione ed origine di replicazione.

S. CEREVISIAE

§         Organismo  unicellulare facile da far crescere in larga scala;

§         Genoma ben conosciuto;

§         Promoter potenti e ben caratterizzati;

§         Capace di eseguire diverse modificazioni post-traslazionali;

§         Secerne poche proteine non interferendo con purificazioni;

§         Sicuro.

Problematiche:

Õ perdita plasmidi;

Õ iperglicosilazione proteine;

Õ accumulo citoplasmatico proteine da secernere.

Trasformare i lieviti mediante:

Õ rimuovere parete cellulare

Õ trattare con acetato di litio

Õ elettroporazione


APPLICAZIONI INGEGNERIA GENETICA

1.      Fermentazioni microbiche (microrganismi modificati vengono utilizzati su scala industriale per la produzione di sostanze);

2.      Vaccini;

3.      Produzione proteine;

4.      Creazione di piante e animali transgenici;

5.      Controllo inquinamento;

6.      Terapia genica (possibilità di somministrare geni a scopo terapeutico);

7.      Diagnostica (infettiva e non).

Tutti gli antibiotici derivano da batteri e funghi purificati: le colture dei batteri rilasciano grandi quantità di questi prodotti.

COLTURE BATTERICHE

Mediante l’ingegneria genetica si manipolano microrganismi.

§         Aumentare la produzione o produrre molecole opportunamente modificate: antibiotici, endonucleasi di restrizione.



§         Alterare pathway metabolici per ottenere maggiori quantità: acido ascorbico; coloranti; aminoacidi; biopolimeri. Agendo su sistemi di controllo si selezionano batteri in grado di dare questi prodotti.

PRODUZIONE PROTEINE PER VACCINI

Problemi legati ai vaccini tradizionali:

§         Agente infettivo problematico da produrre in coltura;

§         Quantità limitata;

§         Misure di sicurezza complesse/costose;

§         Rischio di incompleta inattivazione agente infettivo;

§         Possibile riacquisizione fenotipo “wild”;

§         Problemi stoccaggio/emivita;

§         Vaccini tradizionali inefficaci

Esempio

Il vaccino per l’epatite B è basato sulla somministrazione di un’unica proteina presente sulla superficie esterna del virus. Questa proteina è stata clonata  e fatta esprimere in lieviti (S. cerevisiae) per la produzione di anticorpi

L’ormone della crescita serve per  combattere il nanismo. L’unico modo per ottenerlo era di estrarlo dai cadaveri: questo, però, comportava infezioni e malattie di tipo virale e neurotossico.

L’ingegneria genetica ha permesso di produrre l’ormone della crescita esprimendolo in E. coli. Questo ormone presenta analogie con la prolattina (ormone che garantisce la produzione di latte materno dopo il  parto); per cui l’ormone growth va ad attivare anche il recettore per la prolattina.

L’insulina, un ormone che serve per mantenere normale il livello di glucosio nel sangue, è prodotta come un’unica catena lunga; prima di essere secreta dalle cellule b del pancreas deve subire una serie di modificazioni (peptidasi e poi formazione di ponti disolfuro). Non può essere prodotta da cellule procariote poiché produrrebbero n tipo di insulina inattivo.


CREAZIONE DI PIANTE E  ANIMALI TRANSGENICI

Mediante l’introduzione di frammenti di DNA in uova fecondate o in cellule di piante cresciute in coltura, è possibile ottenere organismi transgenici per:

a)      Aumentare la produzione agricola;

b)      Alterare le caratteristiche nutrizionali di vegetali e animali;

c)      Produrre proteine non prodotte normalmente;

d)      Organi per eseguire xeno-trapianti

Si parla di OGM Organismo Geneticamente Modificato.

DEGRADAZIONE DI SOSTANZE INQUINANTI

§         Esistono microrganismi in grado di degradare/detossificare sostanze tossiche sia naturali che sintetiche (erbicidi, pesticidi, refrigeranti, solventi);

§         Microrganismi (talora isolati da siti contaminati) normalmente contengono geni per la bio- degradazione di sostanze tossiche ed inquinanti. L’ingegneria genetica sfrutta questi geni per creare “super - batteri' per la pulizia ambientale.

La decomposizione microbica di:

·        idrocarburi (ossidazione)  è operata da batteri (pseudomonas, corinebatteri, micobatteri), funghi, muffe e alghe;

·        metano (da batteri metanotrofici);

·        idrocarburi alifatici: i microrganismi si sviluppano in superficie formando una pellicola; ossidano gli idrocarburi a CO2 in presenza  di O2 (in anaerobiosi gli idrocarburi sono stabili); gocce decomposte (optimum, pH, temperatura, nutrienti inorganici come P e N)

·        idrocarburi policiclici e a catene ramificate sono stabili.

·        Pesticidi: declorazione riduttiva.

 

TERAPIA GENICA

1.      Regolare espressione di geni terapeutici per terapia anti- tumorale, anti- infiammatoria;

2.      Anti- sense therapy: si cerca di modulare l’espressione di un gene a livello dell’mRNA. Si somministra un oligonucleotide complementare alla molecola di RNA che si vuol distruggere e così si crea una molecola ibrida con un RNA a doppia catena.

3.      Somministrare gene terapeutico per malattie genetiche (talassemia: poca produzione di globuli rossi; malattie di accumulo: nei macrofagi manca l’enzima deputato alla degradazione di determinati metaboliti; fibrosi cistica: deficit nel trasporto elettrolitico attraverso la membrana; distrofia muscolare).

INGEGNERIA GENETICA NELLE PIANTE

Maggiore produzione / alto valore nutritivo; è già applicata a granoturco, riso, grano.

Le piante possono essere ingegnerizzate introducendo un gene in cellule mantenute in coltura  in vitro e quindi si può rigenerare una pianta fertile dalle cellule trasformate.

 

Come introdurre il gene di interesse in una cellula vegetale?

 

1.      Elettroporazione;

2.      Gene gun: è un approccio più cruento, il DNA è sparato all’interno delle cellule;

3.      Plasmide Ti (Tumor inducing), formato da 15 – 24 Kb, da batterio Agrobacterium tumefaciens; la sua ORI non è riconosciuta in E.coli

Il metodo più semplice per introdurre un gene di interesse in una cellula vegetale è il plasmide Ti.

Problemi:

produzione di fitormoni: previene maturazione cellulare;

produzione opine distoglie  energie e risorse;

Ti ampie dimensioni: aggiunta di geni da clonare diviene instabile;

plasmide Ti non si replica in E.coli

Soluzioni:

aggiunto sito di replicazione per E.coli; 

aggiunto polylinker;

marker per selezionare cellule transfettate (neomicina fosfotransferasi >kanamicina R)

eliminati geni per opine, auxine, citokine e vir.

Il plasmide tumefaciens riesce a trasferirsi dal batterio alle cellule vegetali. Riesce a trasferire materiale genetico da una cellula procariotica ad una eucariotica. Quando il plasmide è trasferito è responsabile di determinare masse pseudotumorali (vicino a delle piante si formano dei rigonfiamenti dovuti al rapporto instaurato  tra il batterio/pianta. Se si verifica un taglio nello stelo della pianta, la pianta stessa opera una riparazione e produce sostanze (ferormoni) che sono in grado di aumentare la proliferazione delle cellule o di favorire la chiusura della lesione.

Le opine sono AA modificati che servono per il metabolismo del batterio.

Nella regione VIR (sta per virulenza) ci sono 5 – 6 geni indispensabili affinché ci possa essere l’adesione del batterio alla cellula vegetale e ci sia il trasferimento del materiale genetico della cellula batterica a quella vegetale.

Nella regione T-DNA si verifica il processo di coniugazione.

La capacità di spostamento nel plasmide è molto interessante, ma lo si doveva modificare tenendo conto solo delle caratteristiche che servivano. Sono stati eliminati i geni di virulenza.

Si è costruito un plasmide che assomiglia al T-DNA ma di esso conserva solo  le estremità. Il plasmide modificato si fa passare nel tumefaciens. Il batterio ha due plasmidi e per questo viene detto “binario”, poiché un plasmide non può funzionare senza l’altro:

                          T-DNA Trasporta informazioni genetiche che vogliamo trasferire alla cellula

                           vegetale

                           ORI-VIR Controlla il processo

 Gen Gun ed elettroporazione funzionano bene con pomodori e patate, meno bene con le graminacee.


APPLICAZIONI DELL’INGEGNERIA GENETICA IN AGRICOLTURA

Piante resistenti a patogeni               

·        Bacillus thuringiensis > Bt –Toxin le piante possono essere indotte a produrre tossine contro i parassiti, si difendono solo dagli acari.

·        Coat protein virus tabacco.

Piante resistenti a erbicidi

·        Erbicida “glifosfato” uccide piante bloccando la sintesi di AA aromatici (trasferire il gene per sintesi di AA aromatici di origine batterica che è resistente all’azione del “glifosfato”): agisce come un antibiotico in cui il target è la cellula vegetale.

·        Ridurre up-take erbicida. Si agisce a livello delle membrane cellulari dove si possono creare         processi di assorbimento della sostanza tossica.

·        Ridurre l’abilità dell’erbicida di legare la proteina target nella pianta.

·        Resistenza stress – senescenza: consente l’irrigazione con acque ricche di sali (vantaggio per le regioni semi desertiche). Si parla di senescenza nei frutti quando si bloccano i fenomeni di maturazione per cui il frutto marcisce e questo va a vantaggio dei produttori. L’impatto ambientale è forte poiché si introducono nell’ambiente piante geneticamente modificate.

·        Modificare pigmentazione dei fiori.

·        Modificare il contenuto nutritivo delle piante:   ® a scopo vaccinologico (far esprimere a piante

                                                                                        zuccheri/proteine oppure utilizzate per

                                                                                         esprimere  un vaccino.

                  

                                                                                   ® fonte di zuccheri/lipidi






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