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IL LAVORO IN CONDIZIONI STERILI

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IL LAVORO IN CONDIZIONI STERILI.


Per imparare a lavorare in sterilita' e' meglio osservare attentamente una persona esperta, dato che un testo scritto non e' un mezzo ottimale per imparare le manovre e le manipolazioni che dovranno essere fatte. Comunque si possono riportare alcuni consigli e descrivere gli errori principali.

Lavorando in cappe sterili, una parte di contaminazione dovuta all'ambiente circostante viene ridotta. Tuttavia, la contaminazione di origine 'ambientale' e' ancora la maggiore fonte di inquinamento delle colture.

Anche lavorando sotto cappa, e' ovvio che la stanza deve essere il piu' possibile pulita e possibilmente disinfettata. Abbiamo gia' detto che l'aria dovrebbe essere filtrata, specialmente se si lavora in ambienti condizionati, per evitare che vengano introdotte spore di varia origine. Se e' possibile, e' bene fare istallare lampade UV nella stanza per una decontaminazione notturna, anche se vi e' una certa controversia in letteratura sull'efficacia di questi sistemi, che oltretutto provocano la formazione di ozono, che, come e' noto, e' piuttosto nocivo.



Bisogna ricordare inoltre che la zona frontale della cappa (i primi 20 cm, di solito caratterizzati dalla presenza di fori piccoli e numerosi, vedi ura 3.1) e' la zona attraverso la quale viene risucchiata l'aria esterna contaminata. Lavorare in quest'area e' praticamente uguale a lavorare al di fuori della cappa.


ura 3.1

Possiamo scrivere un piccolo elenco di regole basilari. Molte sono frutto piu' che altro del buon senso, come ad esempio portare camici puliti, guanti, mascherine (specialmente se si e' raffreddati o peggio, o se si lavora con materiale potenzialmente patogeno).

Le regole sottoriportate non sono ovviamente sufficienti a garantire di non ritrovarsi contaminazioni, maaiutano!.


Usare pipette cotonate e NON pipettare MAI a bocca, ma usare sempre propipette o pipettatori automatici.

Usare pipette automatiche con puntali sterili per piccoli volumi.


Lavorare sotto cappa possibilmente con un bunsen da cappa a portata di mano.

Cercare di mettere tutto il necessario per il lavoro da fare dentro la cappa prima di cominciare, in modo da evitare di entrare e uscire in continuazione dalla cappa. Tutti i movimenti infatti perturbano il sistema di flusso laminare creando turbolenze e quindi rendendo inefficiente la cappa. D'altra parte evitare di riempire la cappa di materiale (inutile) ma tenere solo quanto necessario. La presenza di troppo materiale non solo perturba il flusso, ma impedisce anche di lavorare nella zona sterile della cappa.

Tenere le pipette in modo che puntino verso avanti e non verso l'operatore. Evitare di tenerle in modo che siano sotto il braccio, e non toccarle mai con le mani. Lavorando sotto cappa, evitare non solo che la punta esca dalla cappa, ma anche superi la parte frontale di sbarramento, che corrisponde al piano forellato a fori piccoli dove si crea la barriera d'aria.

Non appoggiare mai una pipetta liberata dall'involucro protettivo sul piano di lavoro della cappa.

Allentare i tappi delle bottiglie e delle fiasche prima di scegliere e montare la pipetta sul pipettatore. Questo spesso permette di lavorare tenendo il tappo della bottiglia in uso in mano (senza contaminarlo) e di richiudere la bottiglia (o la fiasca) nel piu' breve tempo possibile e di evitare ginnastiche improbe per svitare un tappo con il mignolo e senza contaminare la pipetta.

Non passare MAI sulle fiasche o sulle bottiglie aperte con le mani o con le braccia.



Richiudere le cose il piu' presto possibile.

Se si usano pipette o provette o puntali sterilizzati tutti insieme, non toccate tutto per prelevare le cose necessarie, ma fare scendere il materiale tenendo la scatola o il vaso di sterilizzazione, e se si tocca qualche cosa di aperto, eliminarlo.

Se la punta della pipetta tocca l'esterno di una bottiglia, o materiale non rigorosamente sterile, scartarla. Meglio eliminare una pipetta dubbia che un esperimento.

Scartare tutto il materiale che puo' essere fonte di contaminazione in un apposito recipiente riempito di liquido disinfettante (preferibilmente ipoclorito).

Non lasciare fondi di terreni di coltura o altri liquidi in giro, dato che sono un'ottimo punto di crescita di inquinanti.

Se qualcosa schizza o si rovescia, asciugare IMMEDIATAMENTE con un batuffolo di ovatta o un fazzoletto di carta pulito, e subito dopo passare etanolo al 70%.

Tutto quello che e' stato preriscaldato in bagno d'acqua DEVE essere asciugato e passato con etanolo al 70%. I bagni e' bene che contengano agenti batteriostatici.

Se cade un tappo o se viene toccato con le mani o ci viene posato sopra qualcosa, eliminarlo e prenderne uno nuovo e sterile.

Passare alla fiamma del bunsen il materiale prima e dopo averlo usato, ricordandosi che la plastica fonde prima del vetro e che i tappi delle bottiglie hanno delle guarnizioni che non si devono deformare. Una guarnizione deformata non compie piu' il lavoro per cui era stata progettata, che e' quello di SIGILLARE ERMETICAMENTE le bottiglie contenenti medium sterile Inoltre e' meglio evitare di saldare il tappo al collo della bottiglia per eccesso di flambatura.

Evitare di portare gioielli come anelli e bracciali che possono essere una buona fonte di sporco.

Lavarsi bene la mani e possibilmente le braccia prima di cominciare a lavorare, e non toccare niente di sporco. Nel caso, passarsi sulle mani del disinfettante.

Mettere i guanti ricordandosi che non sono sterili; eventualmente passarli con etanolo.


Infine, una precauzione riguarda le contaminazioni non da microorganismi, ma da cellule superiori: se si portano avanti diverse linee cellulari, o la stessa linea viene sottoposta a diversi trattamenti, evitare di operare sotto cappa con tutte contemporaneamente, ma tenerle rigorosamente separate: questo evita spiacevoli sorprese e risultati sbagliati.


Anche gli incubatori possono essere fonte di inquinamento. I gas in entrata (aria e CO2) devono essere filtrati con filtri da 0.2 M.  In quelli umidificati da una vaschetta piena d'acqua posta sul fondo dell'incubatore, e' bene mettere degli antimuffa nell'acqua, come del paraidrossibenzoato, o semplicemente del filo di rame. Gli incubatori devono essere frequentemente puliti e controllati. Nel caso di inquinamento delle colture, e' necessario eliminare velocemente le fiasche contaminate e decontaminare l'incubatore. E' bene inoltre evitare di aprire e chiudere in continuazione, di mettere materiale sospetto e entrarci con le mani sporche.



3.1 COME MANEGGIARE PIPETTE E PUNTALI E FILTRI DA SIRINGA

Se si usano le pipette di plastica monouso confezionate singolarmente, vengono 'sbucciate' tenendole con la sinistra (per i destrimani, viceversa per i mancini) nella parte centrale ANCORA COPERTA DALL'INVOLUCRO, mentre con la destra si apre l'involucro, BADANDO BENE DI APRIRLO DALLA PARTE SUPERIORE DELLA PIPETTA, dove c'e il cotone e MAI dalla parte della punta. Si monta la pipetta sul pipettatore tenendola incartata e POI si toglie l'involucro.



Se si usano i puntali sterili per le pipette automatiche, si deve allontanare il coperchio e infilare il puntale sulla pipetta senza toccare niente con le dita. La pipetta viene tenuta perpendicolarmente sulla scatola. Oggi sono state commercializzate delle scatole portapuntali autoclavabili che hanno il coperchio che scorre sulla scatola, permettendo di scoprire una fila di puntali per volta, e permettendo di mantenere incontaminati gli altri.

Abbiamo visto nel modulo 2 che un sistema di sterilizzazione consiste nella filtrazione dei medium su filtri con porosita' da 0.2 . Ovviamente la filtrazione avviene sottocappa in recipienti sterili. ˝ sono filtri adatti per diversi sistemi e per diverse capacita'. Molto usati sono i filtri da siringa, per filtrare piccoli volumi. Anche in questo caso si opera in modo da evitare di contaminare il filtro. Questo viene venduto in confezioni singole: si apre la confezione portando via la copertura di carta e si mantiene il filtro nell'involucro di plastica. La siringa, riempita con il liquido da sterilizzare, viene montata tenendo il filtro attraverso l'involucro. Se si deve riutilizzare il filtro, lo si ridepone nel suo involucro, si riempie di nuovo la siringa e si rifiltra. Dato pero' che queste manovre diventano un po' pericolose, e' meglio procurarsi le sirighe di varie capacita', anche elevate (20 o 50 ml) piuttosto che rischiare.


3.2 COME ALIQUOTARE I LIQUIDI DA UNA BOTTIGLIA, FIASCA O PROVETTA

La maniera 'perfetta' di maneggiare i tappi e' quella di 'agganciarli' con l'indice e chiudere la 'tenaglia' con il dorso del medio (ovviamente l'abilita' in queste manovre dipende anche dalla dimensione delle mani e dalla loro agilita', nonche' dalle dimensioni dei tappi, che sono spesso grandi perche' si preferiscono bottiglie a bocca larga). Se teniamo il tappo in questo modo, una volta impugnata la bottiglia con la stessa mano ci troviamo con la parte interna del tappo che non tocca mai la bottiglia e non si trova mai sotto le mani o le braccia dell'operatore. Nel caso non si riesca ad assumere questo tipo di controllo, i tappi vengono appoggiati sul retro della cappa con l'apertura verso l'alto, ma bisogna fare molta attenzione alle manovre.

Una volta aperta la bottiglia (o fiasca o provetta), bisogna ricordarsi che non va MAI presa vicino al collo. E' anche bene evitare di toccare con la pipetta la parete dei contenitori, sia nel prelevare che nel dispensare.

Quando prepariamo dei terreni, e' sempre bene non prepararne quantita' eccessive, perche' una contaminazione porta a buttare via molto materiale. Le soluzioni madri (o stock) come ad esempio i sieri, gli antibiotici, la glutamina, che sono normalmente vendute o preparate in una certa quantita' (e maggiore e' il volume per confezione, piu' basso e' il prezzo), vengono immediatamente suddivise in piccole aliquote in provette sterili e conservate secondo quanto riportato sulle confezioni, di solito a -20 C o a 4 C. Si aprono quindi solo le provette che contengono il materiale necessario.

Se abbiamo preparato un grosso volume di terreno, la precauzione migliore per evitare contaminazioni e' prelevare la quantita' necessaria (un po' abbondante) versandola (sotto cappa!!) in una provetta sterile, richiudere la bottiglia, metterla via e utilizzare il medium nella provetta.


3.3 LA PROVA DI STERILITA'. La contaminazione puo' non solo mandare all'aria il nostro lavoro ma essere anche molto difficile da debellare e puo' anche proarsi al lavoro degli altri. Quindi ogni precauzione e' benvenuta. Quando prepariamo i medium o aliquotiamo i terreni e le varie soluzioni, e' sempre meglio fare una prova di sterilita': questa consiste nell'aggiungere 1 ml delle soluzioni da saggiare a 4 ml di un brodo (terreno liquido) universale per le colture batteriche. Questo viene fatto in una provetta sterile e posto in incubatore. Gia' dopo 24 ore con molti tipi di batteri si vede il brodo assumere una caratteristica torbidita'. La precauzione migliore e' comunque quella di lasciare le prove di sterilita' almeno una settimana in incubatore per permettere la proliferazione anche di specie a crescita lenta. E' ovvio che se riscontriamo contaminazione il terreno o la soluzione saggiata verra' prontamente eliminata.






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