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Per una visione aggiornata del mercato immunologico - Anticorpi e immunoreagenti

Per una visione aggiornata del mercato immunologico - Anticorpi e immunoreagenti


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Per una visione aggiornata del mercato immunologico Anticorpi e immunoreagenti

Negli ultimi anni, l'offerta di prodotti e servizi immunologici è cresciuta a dismisura.
Sono disponibili anticorpi specifici per un numero sempre maggiore di antigeni, solubili, immobilizzati (a piastre, resine o membrane) coniugati e non
Inoltre, il continuo ampliamento della gamma di sistemi di rivelazione dei complessi antigene-anticorpo, unitamente al miglioramento della loro sensibilità, hanno contribuito ad estendere enormemente
le potenzialità ed il campo di applicabilità delle reazione e delle tecniche immunologiche.

Senza la possibilità di disporre di anticorpi come mezzi potentissimi di rivelazione specifica di proteine, acidi nucleici, virus, batteri., gran parte dei progressi e delle scoperte della biologia non avrebbero avuto luogo. Data l'indiscussa importanza e la diffusione di utilizzo di anticorpi e di immunoreagenti nei settori più diversi, crediamo sia utile fare una panoramica (che sarà necessariamente incompleta vista la vastità dell'offerta) delle caratteristiche e delle potenzialità applicative dei vari prodotti attualmente presenti sul mercato. Per la maggior parte delle tecniche che fanno uso di anticorpi esistono in commercio i singoli prodotti oppure dei kit completi che includono tutti o quasi i reagenti richiesti per una particolare procedura, unitamente ai protocolli raccomandati. Anticorpi primari e secondari, tecniche di coniugazione, sistemi di rivelazione dei complessi antigene-anticorpo e servizi offerti dalle aziende in questo settore saranno tra gli argomenti principali dell'articolo.




Anticorpi monoclonali
o policlonali?
Gli anticorpi o immunoglobuline (. 1) secreti in vivo in risposta all'immunizzazione con uno o più antigeni sono policlonali, perché vengono stimolate diverse cellule B che riconoscono regioni o epitopi differenti sull'antigene immunogeno. Si possono produrre antisieri in un'ampia gamma di animali (topo, ratto, coniglio, capra).
In genere, si fanno due o più iniezioni di antigene insieme a un adiuvante (un agente che potenzia in modo aspecifico la risposta immunitaria) e, per piccole molecole, con un carrier (che porta i determinanti riconosciuti dalle cellule T helper, che 'aiutano' la risposta anticorpale). Dopo ripetute immunizzazioni, gli anticorpi prodotti saranno essenzialmente IgG; per eliminare gli anticorpi di specificità indesiderate, si può far adsorbire l'antisiero.
Diversamente dai policlonali, gli anticorpi monoclonali (MAb)derivano da un singolo clone di cellule B (che produce anticorpi di una sola specificità).
Il modo più diretto di produrre anticorpi monoclonali è la tecnica degli ibridomi di Kohler e Milstein (vedi riquadro). Alternativamente, le cellule B umane possono essere immortalizzate usando il virus Epstein-Barr (EBV) e poi clonate, per produrre anticorpi monoclonali umani.
Per la produzione commerciale di MAb, le cellule possono essere coltivate in bioreattori che permettono alle cellule di crescere ad alte densità, secernendo attivamente grandi quantità di anticorpo (parecchi grammi/settimana).
Gli anticorpi monoclonali forniscono reagenti con una singola specificità in quantità potenzialmente illimitata.
Gli anticorpi policlonali contengono invece molteplici specificità ma la loro quantità è generalmente limitata dall'ammontare di siero che si riesce ad ottenere dall'animale immunizzato. Bisogna dire però che, da animali iperimmunizzati di taglia intermedia come ad esempio il coniglio, si riesce ad ottenere abbastanza siero per raggiungere un titolo anticorpale sufficiente per alcuni anni. (Ricordiamo che il titolo di un anticorpo indica la più bassa concentrazione [o la più alta diluizione] che è ancora efficace in un dato saggio, ad esempio l'agglutinazione, ossia la formazione di aggregati insolubili tra anticorpi e antigeni cellulari o comunque particolati).
Anche se può sembrare strano, gli anticorpi policlonali possono talvolta fornire una specificità maggiore di quella di anticorpi monoclonali diretti contro lo stesso antigene. Questo perché da un siero policlonale si riescono ad eliminare problemi di cross-reazioni indesiderate mediante adsorbimento con l'antigene che verso cui si verificano tali cross-reazioni. Nessuna cross-reazione può essere invece eliminata da una soluzione di anticorpo monoclonale, perché questo è dotato di una singola specificità. La specificità degli anticorpi policlonali può anche essere aumentata mediante cromatografia di affinità usando l'antigene purificato.

Tecniche di rilevazione di antigeni e anticorpi
Esistono un gran numero di tecniche immunologiche per rivelare e/o quantificare antigeni o anticorpi.
Quando si tratta di antigeni e anticorpi solubili, i saggi si basano sulla marcatura di uno dei reagenti, sulla formazione di immunocomplessi che precipitano, o sulla misurazione di una funzione effettrice dell'anticorpo come l'agglutinazione o la fissazione del complemento.
Tra i metodi disponibili rientrano l'ELISA (enzyme-linked immunoadsorbent assay) e il RIA (radioimmunoassay). C'è poi l'immunoprecipitazione su gel che comprende vari saggi che si basano sulla diffusione di uno (immunodiffusione radiale singola) o entrambi i reagenti (immunodiffusione doppia), sulla separazione elettroforetica dell'antigene seguita da diffusione dell'anticorpo (immunoelettroforesi).
Se gli antigeni o gli anticorpi sono intracellulari o legati alla membrana, si possono usare diverse procedure, alcune delle quali sono simili a quelle utilizzate per la rivelazione di antigeni solubili. L'immunofluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per sispensioni di cellule, cellule aderenti in monostrato e sezioni di tessuti; essa permette di attribuire un dato antigene a una data cellula (e magari anche ad un determinato sottotimento interno) e necessita di un microscopio a fluorescenza o di un citofluorimetro di flusso.
L'immunoistochimica è un buon metodo per la rivelazione di antigeni associati alle cellule in sezioni di tessuti, mentre la tecnica immunogold (basata su anticorpi marcati con oro) permette una localizzazione molto precisa dell'antigene all'interno di cellule e tessuti, se combinata con la microscopia elettronica.

Caratterizzazione degli anticorpi
Le principali caratteristiche che bisogna stabilire di un anticorpo (e che le aziende devono accuratamente verificare prima di poter vendere un anticorpo) sono la classe della catena pesante e di quella leggera, la specificità antigenica, la specificità per l'epitopo, e l'affinità.
La classe e la sottoclasse si possono determinare con anticorpi specifici per le singole classi o isotipi (mediante tecniche ELISA, RIA, di immunodiffusione radiale).
Quasi sempre la specificità di un anticorpo che prodotto è nota, ma la sua cross-reattività può non esserlo. È importante accertare che il sistema che si intende utilizzare non presenti cross-reazioni indesiderate. Ciò si può verificare sottoponendo a screening contro pannelli rilevanti di anticorpi, antigeni e/o tessuti (mediante RIA, ELISA, immunodiffusione, immunofluorescenza, immunoistochimica).
Se si dispone di più di un anticorpo monoclonale contro un dato antigene, è spesso preferibile determinare se riconoscono lo stesso epitopo o epitopi diversi sull'antigene. Ciò è importante se si vogliono ad esempio utilizzare due anticorpi monoclonali in un saggio sandwich, dato che questi devono riconoscere epitopi differenti. Lo screening si può fare con un test ELISA per inibizione o sandwich: se con questi approcci si rivelano nuove specificità può essere utile definire ulteriormente l'epitopo riconosciuto. Nel caso di epitopi discontinui, si possono generare frammenti di antigene mediante taglio con enzimi proteolitici o attraverso le tecniche del DNA ricombinante, e si può analizzare la reattività dei MAb contro i frammenti usando test ELISA e immunoblotting.
Infine, l'affinità di un anticorpo è un'altra caratteristica importante da determinare, anche se è di difficile misurazione e può variare in funzione del metodo usato.

Anticorpi primari
Preparazione
Per iperimmunizzare gli animali ospiti (in genere, capre, topi, conigli, ratti e pecore) si usano antigeni altamente purificati, la maggior parte dei quali sono isolati da plasma, da siero o da lisati cellulari usando varie procedure cromatografiche (filtrazione su gel, cromatografia a scambio ionico e bioaffinità). Tra gli anticorpi primari presenti in commercio rientrano antisieri per diverse applicazioni (antisieri specifici, per immunostaining, per applicazioni forensi), frazioni IgG,, frammenti Fab e F(ab')2, anticorpi purificati per affinità e anticorpi monoclonali.
Gli anticorpi per applicazioni forensi sono antisieri specifici anti-siero intero ulteriormente processati attraverso adsorbimento per affinità per rimuovere gli anticorpi che cross reagiscono con altre specie comuni
Le frazioni IgG sono preparate da antisieri specifici in genere mediante precipitazione in solfato di ammonio e cromatografia a scambio ionico, filtrate e liofilizzate. Solitamente, non vengono aggiunti conservanti per permetterne l'uso diretto in saggi con cellule 'in vivo' e per marcatura radioattiva e coniugazione)
I frammenti Fab e F(ab')2 sono preparati da frazioni IgG specifiche mediante digestione controllata con papaina e con pepsina, rispettivamente (. 2). Sono purificati mediante cromatografia, dializzati, filtrati e liofilizzati,e sono generalmente privi di conservanti
Gli anticorpi purificati mediante cromatografia di affinità vengono preparati da frazioni IgG specifiche mediante immunoadsorbimento su antigeni in fase solida, dilizzati, filtrati, senza aggiunta di conservanti.
Infine, ci sono gli anticorpi monoclonali, venduti sotto forma di asciti o di supernatanti di colture cellulari oppure di anticorpi monoclonali purificati. Gli ibridomi di topo sono in genere prodotti fondendo cellule di mieloma e cellule di milza di topi Balb/C immunizzati con un antigene purificato. Le cellule clonate dagli ibridomi sono iniettate in topi per produrre asciti o sono fatte crescere in coltura per produrre supernatanti. Asciti e supernatanti sono chiarificati mediante centrifugazione e filtrazione, mentre per produrre anticorpi monoclonali purificati si usa cromatografia di affinità utilizzando proteina A o proteina G. Tutte e tre le forme di anticorpi monoclonali commercializzate contengono in genere conservanti.

Specificità e purezza
Per specificità si intende la specificità per l'antigene e per la specie.
La maggior parte dei prodotti in commercio sono testati attraverso tecniche di immunoelettroforesi per verificarne la specificità, utilizzando controlli sia positivi che negativi. Gli anticorpi monoclonali e per immunostaining sono testati anche in immunoblotting, immunostaining di cellule o tessuti e/o in ELISA.
Per quanto riguarda la specie-specificità, i prodotti contrassegnati 'no cross species' non hanno mostrato cross reattività in immunoelettroforesi con le IgG delle specie indicate.
L'analisi della purezza varia a seconda del tipo di anticorpo. Le frazioni IgG in commercio, come anche gli anticorpi purificati per affinità, non presentano tracce di albumina.
I frammenti Fab e F(ab')2 sono testati con siero e IgGFc anti-specie ospite: per privarle completamente di IgG intere, di frammenti Fc o di altre proteine del siero.
Gli anticorpi monoclonali purificati sono testati su gel SDS riducente, in modo da ottenere una purezza del 97-99%).
L'agente conservante Sodio Azide (NaN3) spesso aggiunto alle soluzioni di anticorpi può essere facilmente rimosso mediante dialisi.

Campi di applicazione
Gli anticorpi primari e relativi reagenti trovano applicazione in vari campi della ricerca, della diagnostica e delle analisi in genere. Le società produttrici più serie offrono anticorpi e immunoreagenti ottimizzati per le singole applicazioni.
Gli anticorpi per Biologia Cellulare sono ottimizzati per le applicazioni più frequenti in questo campo (saggi di immunoblotting e per la localizzazione immunoistologica di proteine in sezioni di tessuti e cellule in coltura). Tra gli anticorpi per Biologia Cellulare rientrano quelli specifici per proteine e componenti del citoscheletro, per molecole di adesione, per antigeni cellulari umani, per proteine coinvolte nel ciclo celluare e proteine nucleari. Citiamo tra questi dei nuovi anticorpi commerciali specifici per le proteine del ciclo cellulare, che permettono di condurre studi di differenziazione, oncogenesi, trasduzione del segnale e apoptosi. Questi anticorpi purificati per affinità, altamente specifici, sono disponibili per i membri di tre classi di proteine molto importenti nel ciclo cellulare: cicline, chinasi ciclina-dipendenti (CDK) e inibitori delle CDK. Adatti per immunoprecipitazione, Western blotting e immunofluorescenza, questi anticorpi sono prodotti contro singoli peptidi in modo da massimizzarne la specificità e permettere esperimenti di competizione con il peptide (. 3)
Gli anticorpi per applicazioni nel campo delle Neuroscienze sono diventati dei mezzi sempre più importanti per studiare lo sviluppo, il differenziamento e la localizzazione di cellule neuronali e non nel sistema nervoso centrale (CNS) e in quello periferico.
Un altro campo applicativo è quello della citoluorimetria di flusso.
La marcatura fluorescente di antigeni di superficie permette di analizzare e 'sortare' diverse popolazioni di leucociti a seconda dell' intensità di fluorescenza e delle proprietà di scattering della luce. L'analisi mediante immunofluorescenza multicolore di sottopopolazioni leucocitarie non è mai stata così facile, grazie alla disponibilità di anticorpi coniugati con fluorocromi diversi.Gli anticorpi commerciali per analisi in citofluorimetria di flusso (ottimizzati per questo tipo di applicazione) includono anticorpi contro gli antigeni CD umani e murini e i loro coniugati, anticorpi secondari coniugati a fluorocromi e vari controlli.
Anche nel campo sempre più di moda della Biologia Molecolare, l'uso di anticorpi sviluppati per aiutare l'identificazione di proteine di fusione e per la rivelazione di sonde DNA/RNA. Questi reagenti possono essere utilizzati in ELISA, immunoblotting e immunocitochimica.



Anticorpi secondari e coniugati
Gli anticorpi secondari specifici per immunoglobuline umane e animali sono venduti generalmente come asciti, anticorpi purificati per affinità, frazioni IgG e antisieri. Sono sviluppati in topo, ratto, capra o pecora, utilizzando proteine purificate come immunogeni.Gli antisieri anti-topo (anti- catena pesante) sono ad esempio sviluppati in pecora o capra usando come antigeni immunogeni proteine monoclonali o proteine di mieloma purificate. I prodotti specifici per la catena pesante sono adsorbiti, mediante tecnice di fase solida, per ottenere la specificità voluta e testati per eventuali cross-reattività.
Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell'avvenuto legame antigene-anticorpo secondario consiste nella coniugazione dell'anticorpo (o anche dell'antigene) con una molecola che può essere direttamente rivelata. Questa molecola può essere un enzima, un fluorocromo, un radioisotopo (soprattutto 125I ma anche 14C, 3H, 32P 35S), biotina o oro.
Per alcune applicazioni viene ampiamente utilizzata la marcatura biosintetica, ossia l'incorporazione stabile di un aminoacido marcato (35S metionina, 3H lisina, 3H arginina, 3H leucina o 3H fenilalanina), tecnica che ha il vantaggio di non necessitare di una reazione di accoppiamento chimico che potrebbe danneggiare l'anticorpo. La marcatura biosintetica necessita di far crescere le linee cellulari che producono un dato MAb in un terreno privo dell'aminoacido usato per la marcatura. I problemi di questa tecnica sono la relativamente bassa attività specifica e l'inapplicabilità ad anticorpi policolonali.
Gli anticorpi coniugati, indipendentemente dalla molecola marcatore utilizzata, sono preparati da frazioni IgG di antisieri o da anticorpi purificati per affinità e sono purificati mediante gel filtrazione. Sono adatti per un gran numero di tecniche immunologiche tra cui ELISA, citofluorimetria di flusso, immunoistochimica e immunoblotting. La scelta del tipo di marcatura dipende in gran parte dal tipo di saggio per cui l'anticorpo dovrà essere utilizzato.

Anticorpi coniugati ad enzimi
Gli enzimi i più utilizzati sono quelli che causano un cambiamento di colore di un substrato, come l'enzima perossidasi di rafano (Horse Radish Peroxidase, HRP) o forfatasi alcalina (alcaline phosphatase, AP).
Gli anticorpi coniugati ad enzimi sono adatti per saggi EIA, ELISA, immunostaining di cellule e tessuti in microscopia ottica ed elettronica e per immunostaining di blot o immunoblotting.

Anticorpi coniugati a fluorocromi
Tra i fluorocromi la fluoresceina isotiocianato (FITC) è la molecola d'elezione per studi di immunofluorescenza (immunofluorescence assay, IFA), dato che la procedura di coniugazione è estremamente semplice e il segnale emesso è relativamente forte. In caso di analisi a due colori, sono ampiamente utilizzati anche i fluorocromi tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC), il Texas Red TR) o la ficoeritrina (PE). Altre applicazioni degli anticorpi coniugati oltre ai saggi IFA, sono lo staining di cellule e tessuti (rilevabile con la microscopia in fluorescenza), immunoblotting e staining di cellule per cell sorting.

Anticorpi biotinilati
Il sistema di marcatura avidina:biotina si basa sull'elevata affinità di legame (Ka=1015) dell'avidina per la biotina (vitamina H). Ma oltre all'avidina è stata purificata anche una molecola simile, la streptavidina, che presenta un minore background, nonché alcune varianti dell'avidina con caratteristiche ottimizzate.
L'elevata affinità di legame avidina-biotina è utilizzata nei saggi immunologici coniugando proteine come gli anticorpi alla biotina (biotinilazione) e coniugando molecole reporter come enzimi e fluorocromi all'avidina. Le applicazioni della marcatura avidina-biotina, per cui è anche disponibile un gran numero di kit più o meno completi, includono enzyme immunoassays (EIA), immunostaining di cellule e tessuti, immunoblotting, citofluorimetria di flusso. In ura 5 è mostrato un esempio idei risultati che si ottengono con un kit per immunostaining contente anticorpi biotinilati rivelati con un sistema di streptavidina coniugata ad enzimi.

Anticorpi coniugati a oro
L'oro è un marcatore denso agli elettroni che viene utilizzato per la rivelazione/quantificazione di proteine, antigeni e acidi nucleici. Attraverso una forte interazione non covalente, l'oro può essere coniugato ad anticorpi per l'impiego in saggi immunologici. L'oro coniugato ad anticorpi è utilizzato in procedure di microscopia elettronica e ottica e di immunoblotting. I coniugati anticorpo-oro colloidale consistono in una sospensione di particelle d'oro rivestite da molecole di un dato anticorpo (. 6). Tali particelle possono essere di dimensioni comprese tra 1 e 250 nm. In questi saggi, il colore rosso dell'oro accumulato è visibile su una membrana nel punto cui l'antigene è stato immobilizzato, oppure in soluzione, dove l'oro permette una rivelazione estremamente sensibile di quantità di proteine inferiori al nanogrammo.
La disponibilità di una così ampia gamma di dimensioni è importante, perché permette di studiare antigeni in microscopia a molti ingrandimenti diversi e permette la marcatura multipla di antigeni in sezioni di tessuto.
In microscopia elettronica le particelle d'oro sono visibili senza alcun ulteriore trattamento, mentre per analisi in microscopia ottica o per la rivelazione a occhio nudo rivelazione dell'antigene necessitano di una breve procedura di potenziamento mediante Silver per aumentare notevolmente la sensibilità del saggio.

Proteina A e proteina G
La proteina A di Staphylococcus e la proteina G di Streptococcus si legano al frammento Fc delle catene pesanti. Bisogna sempre tenere presente però che non tutte le classi di anticorpi legano questi ligandi (le IgG1,IgG2, e IgG4 umane e le IgG2a, IgG2b e IgG3 murine legano fortemente la proteina A, tutte le 4 sottoclassi di IgG umane legano fortemente la proteina G, mentre solamente le IgG1 di topo mostrano un debole legame).
In commercio è disponibile una buona scelta di reagenti proteina A e proteina G in forma solubile e insolubile per una varietà di applicazioni tra cui: purificazione di anticorpi e saggi EIA di diverso tipo. La proteina A e la proteina G purificate sono accoppiate a differenti matrici per l'impiego come resine di affinità. Sul mercato esiste anche una proteina A ricombinante che rappresenta un nuovo metodo per la purificazione proteica (. 7).Le proteina A e G .sotto forma di coniugati con enzimi (AP o HRP) e fluorocromi (FITC, TRITC, PE, TR) sono un'alternativa agli anticorpi secondari marcati universali per la localizzazione/visualizzazione delle immunoglobuline.

Reagenti di coniugazione
Le aziende offrono una scelta vastissima di anticorpi già coniugati ad una quasi altrettanto vasta gamma di molecole marker. Se, per risparmiare o perché si necessita di un anticorpo coniugato non disponibile in commercio, si procede personalmente alla coniugazione, sono disponibili reagenti, enzimi e flurocromi adatti allo scopo della marcatura.

Kit e substrati enzimatici
Il substrato dei coniugati enzimatici varia innanzitutto a seconda del tipo di enzima utilizzato, e poi in base al tipo di applicazione (test su micropiastra, blotting su membrana e immunoistochimica).

Substrati e kit per saggi ELISA/EIA in micropiastra
La scelta del substrato deve sempre tener conto del fatto che la sensibilità del saggio non è la stessa sensibilità dell'enzima substrato. La sensibilità di un saggio è definita come la più piccola quantità di antigene che può essere rivelata. La sensibilità di un substrato è la misura della quantità di colore generata da un'unità di enzima. In un dato saggio in cui la quantità di materiale è molto limitata, la sensibilità dell'immunodosaggio può essere limitata dalla quantità di colore generata dal substrato.
Per anticorpi coniugati a fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato pNPP (p-Nitrophenylphosphate) che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-410 nm.
Per anticorpi o streptavidina coniugati a perossidasi si può scegliere tra diversi substrati
Il substrato ABTS perossidasi che sviluppa un colore blu-verde intenso misurabile tra 405 e 410 nm. Oppure il substrato TMB perossidasi che offre un'altissima sensibilità in ELISA in micropiastra; la rapida velocità di reazione ne consente anche l'impiego in saggi cinetici o endpoint. Produce un colore blu scuro misurabile a 650 nm. In ura 8 è rappresentato un saggio EIA su micropiastra che utilizza TMB come substrato di streptavidina coniugata a perossidasi
Un'alternativa molto interessante è rappresentat dalla disponibilità commerciale di substrati e kit per la rivelazione chemiluminescente in micropiastra di anticorpi e sonde marcati con perossidasi.

Substrati per immunoblotting
Il substrato fornisce un metodo per la rivelazione visiva dell'enzima nel coniugato. La scelta dipende dalle richieste del saggio e dalle preferenze personali dell'utilizzatore. nessun substrato è ottimale per tutti i saggi di blotting. Data la disponibilità commerciale di un gran numero di substrati diversi, è possibile lo staining multiplo della stessa membrana.
Per anticorpi o streptavidina marcati con fosfatasi si usa solitamente il substrato BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium) che offre alta sensibilità e basso backgound sulle membrane; esso produce un intenso precipitato color porpora al sito di reazione, la colorazione che si ottiene è molto stabile e resiste al fading quando esposta alla luce.
Per la rivelazione di anticorpi o streptavidina marcati con perossidasi si possono usare il già citati TMB, oppure il substrato 4CN (4 chloro-l-naphtol) che è una valida alternativa ad altri substrati magari più sensibili ma con cui c'è il problema del backgound.
In ura 9 sono mostrati dei blot che utilizzano diversi substrati enzimatici per la rivelazione.
Il substrato per la rivelazione chemiluminescente di anticorpi HRP, descritto per applicazioni in micropiastra, permette una veloce e sensibilissima rivelazione di anticorpi e sonde HRP immobilizzate su membrana. Con questo substrato, i blot possono essere esposti ai raggi X o a pellicole Polaroid ad alta velocità per una registrazione permanente dei risultati (10).

Kit e substrati per immunostaining
In commercio è presente una serie di substrati per la visualizzazione in microscopia ottica di molecole reporter marcate in genere con gli enzimi AP e HRP. La varietà di colori disponibili permette la localizzazione di molteplici antigeni. I reagenti sono forniti come prodotti separati o come parte di kit completi.
I substrati di anticorpi o streptavidina marcati con HRP sono l'AEC (amino-ethyl-carbazole) che fornisce una colorazione rossa, e il DAB (diaminobenzidine) che produce un precipitato marrone al sito antigenico.
Per l'immunostaining di anticorpi /streptavidina marcati con AP si usa spesso il fast Red. Alcuni di tali substrati (ad esempio il DAB) sono adatti anche per saggi di immunoblotting come Wastern e dot blots.
Citiamo la disponibilità sul mercato una serie di kit per immunostaining caratterizzati da un sistema di rivelazione strptavidina-biotina universale, contenente cioé una speciale formulazione di anticorpi secondari biotinilati che permette di utilizzare anticorpi primari provenienti da animali immunizzati di diverse specie utilizzando un solo anticorpo secondario e un solo kit (. 11)



Stoccaggio degli anticorpi
Gli anticorpi possono essere liofilizzati o in forma liquida.
I prodotti liofilizzati devono essere stoccati a 2-8°C o meno. Una volta ricostituiti possono essere conservati nello stesso range di temperatura per circa 2 mesi (previa aggiunta di conservante, come l'agente antimicrobico NaN3). Per un più lungo stoccaggio si dovrebbe dividere il prodotto ricostituito in piccole aliquote da conservare a -20°C per circa 1 anno oppure a -70°C per parecchi anni. È importante non diluire troppo l'anticorpo per non modificarne il titolo; in ogni caso la diluizione deve esempre avvenire con una soluzione salina contenente uno stabilizzatore (ad esempio, PBS + 0,1% BSA). Bisognerebbe evitare il più possibile continui congelamenti e scongelamenti.
Per gli anticorpi commercializzati in forma liquida vale lo stesso discorso degli anticorpi liofilizzati una volta ricostituiti Nel caso che gli anticorpi siano coniugati (a enzimi, fluorocromi, biotina), per una conservazione a lungo termine a -20°C, per prevenire il congelamento, è spesso preferibile aggiungere del glicerolo (40% v/v). Per alcuni coniugati ad enzimi (come ad esempio i coniugati alla AP) può essere invece sconsigliato il congelamento e raccomandata la conservazione a 4°C.

Fattori di crescita, citochine, recettori e realtivi anticorpi
Fattori di crescita, citochine, recettori e i loro anticorpi purificati sono diventati degli strumenti fondamentaleper l'analisi delle strutture e delle funzioni cellulari di queste molecole di grande importanza biologica. I fattori di crescita sono stati purificati di una grande varietà di fonti. Tradizionalmente, i tessuti e le secrezioni animali rappresntano la sorgente principale di fattori di crescita. Tuttavia, molti di questi vengono ora prodotti per via sintetica o grazie alla tecnologia del DNA ricombinante. Tra i prodotti presenti in commercio per l'uso nella ricerca sui recettori e negli studi cellulsari rientrano fattori di crescita purificati, anticorpi mono e policlonali contro i fattori di crescita e i loro recettori, recettori solubili e kit ELISA.

Servizi custom immunologici
I servizi custom di tipo immunologico che parecchie società propongono ai ricercatori riguardano la produzione di anticorpi policlonali (con protocolli adattati alle specifiche richieste del cliente), la generazione di ibridomi e lo scale-up della produzione di anticorpi monoclonali in asciti. Viene spesso offerta assistenza anche per quanto concerne la purificazione, la caratterizzazione, la frammentazione e la coniugazione degli anticorpi voluti. La coniugazione può essere quella tra anticorpo e molecola reporter (enzima, fluorocromo, oro ecc.) oppure tra aptene e carrier , per rendere più immunogenici piccoli antigeni (apteni) che non sono in grado di far partire una risposta immunitaria adeguata, graie alla coniugazione di questi con grosse molecole carrier come ad esempio la siero albumina bovina (BSA).

Anticorpi in forma liquida confezionati e pronti per la vendita da parte delle aziende produttrici e distributrici
(BioSPA - HyCult Biotechnology).

. 1 - Schema della struttura di una molecola di anticorpo formata da due catene pesanti(H) identiche e da due catene leggere (L) pure identiche. I siti di legame per l'antigene sono formate da un complesso delle regioni N-terminali di entrambe le catene L e H.

LA Tecnica degli ibridomi di Kohler e Milstein

I linfociti di un animale immunizzato sono mescolati con una linea di cellule di mieloma (cellule B tumorali) in presenza di un reagente fusogenico, in genere polietilen glicol (PEG).
Si scelgono linee cellulari di mieloma che non secernono anticorpi in modo che venga prodotta una singola specie di anticorpo, che è quella prodotta dalla cellula B normale (non tumorale). La cellula ibrida (ibridoma) eredita la specificità antigenica dalla cellula B normale e l'immortalità dalla cellula tumorale. Le cellule B normali non fuse non sono immortali e muoiono in coltura. Le linee cellulari mielomatose utilizzate sono mutanti selezionati per l'assenza degli enzimi ipoxantina guanina fosforibosil trasferasi (HGPRT) e timidina kinasi (TK) e sono incapaci di utilizzare i pathway di salvataggio della sintesi di acidi nucleici. Quindi, il mieloma mutante muore se viene bloccata la via principale per la sintesi di purine e pirimidine, utilizzando l'analago dell'acido folico aminopterina, dato che nessuno dei due pathway è disponibile.L'ibridoma eredita i geni del pathway di salvataggio dalla cellula B normale ed è quindi in grado di utilizzare ipoxantina e timidina, sopravvivendo in tal modo in un terreno HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Le cellule di un ibridoma possono poi essere clonate diluendole a meno di 1 cellula/pozzetto in piastre da 96 contenenti feeder: le cellule che cresceranno in un singolo pozzetto saranno identiche perché derivate da un'unica cellula. Nel supernatante del clone ottenuto si troveranno gli anticorpi monoclonali secreti.

. 2 - Uso di papaina, pepsina e ficina immobilizzate oer la frammentazione delle IgG (Prodotti Gianni - Pierce)

. 3 - Immunoprecipitazione di CDK4, CDK6 e p16 marcate con 35S utilizzando anticorpi anti-Ciclo cellulare (Genzyme - Clontech ).
Le cellule IMR90 che esprimono le oncoproteine E6 ed E7 di papilloma virud di tipo 16 sono state marcate metabolicamente con metionina 35Se immunoprecipitate con anticorpi anti-CD4, CDè e p16, con o senza pre-incubazione con il peptide antigenico competitivo (pep), e risolte su SDS-PAGE.
Si può notare che i peptidi di controllo CD4 e CD6 sono in grado di inibire completamente la coimmunoprecipitazione.
peptidi antigenici

. 4 - Esempio di staining immuno-fluorescente di cellule di glioblastoma di ratto C6.
La fluorescenza rossa mostra i filamenti di vimentina usando MAb anti-vimentina. La fluorescenza blu è il nucluo sottoposto a co-staining con DAPI (Sigma).

. 5 - Cellule enterocromaffini (EC) immunoreattive per 5HT (serotonina) nell'intestino di topo dopo immunostaining con il kit pronto all'uso BIOSPA immunoperossidasi (in alto) e immunofosafatsi (in basso).
Il kit amplifica il segnale di marcature realizzate con anticorpi primari, tramite anticorpi secondari biotinilati e un sistema stabile di rivelazione con perossidasi o fosfatasi alcalina.

genzyme
Nuovi anticorpi da Genzyme, Clontech e Oncogene R.P.

Genzyme srl mette a disposizione dei ricercatori un pannello completo di reagenti per lo studio della risposta Th1/Th2. I prodotti comprendono anticorpi monoclonali e policlonali con svariate applicazioni comprendenti: FACS, Neutralizzazione, Western Blot e sistemi ELISA.
Tra i sistemi ELISA, oltre ai kit tradizionali a 96 pozzetti con piastra coattata con anticorpo di cattura, è disponibile anche il DuoSet. Questo sistema contiene due anticorpi (Ab) ottimizzati per il funzionamento in Elisa, standard, piastre, reagenti di rivelazione e protocollo dettagliato.
Poiché le citochine sono coinvolte anche nel processo di apoptosi, Genzyme propone per questo studio fattori neurotrofici e Ab monoclonali/ policlonali contro i recettori del TNF (recettore I e II) e contro l'IL-l2. Tra le novità più recenti sono da annoverare le chemochine: human ENA -78 e human GRO-a/MGSA e anticorpi contro CD54, CD62L, CD62E e TSP1.
Genzyme srl informa che CLONTECH ha introdotto a luglio un ampio numero di nuovi Ab (cicline, chinasi-ciclina dipendenti e inibitori della chinasi-ciclina dipendenti) per lo studio del ciclo cellulare. Questi Ab sonovenduti con il rispettivo peptide di controllo e con un lisato cellulare come controllo positivo.
Genzyme segnala inoltre una interessante camna promozionale (scadenza Dicembre '97) sugli anticorpi Oncogene Research Product per l'indagine del ciclo cellulare: acquistando 2 anticorpi si ha diritto ad averne un terzo in omaggio.

italscientifica
IMMUNON SHANDON-LIPSHAW

La SHANDON-LIPSHAW, leader mondiale nell'istologia, propone la linea di prodotti IMMUNON per l'immunoistochimica. La linea di prodotti IMMUNON è composta da tutti gli anticorpi primari per la routine disponibili in forma concentrata e prediluita, dai diversi kit di rivelazione a differente sensibilità e capacità, da tutti i reagenti accessori e da una serie di anticorpi coniugati da utilizzare nelle tecniche di fluorescenza. La SHANDON-LIPSHAW, inoltre, dispone di un pratico sistema per lo sviluppo della reazione antigene-anticorpo che consente di standardizzare la procedura e di utilizzare una ridotta quantità di anticorpi e reagenti. Il sistema si avvale di una pinzetta in plastica denominata COVERPLATETM che viene accoppiata manualmente al vetrino con il campione ed inserita in un apposito contenitore. Tra la parete della COVERPLATETM ed il vetrino si forma una piccola camera della capacità di 100 µl; gli anticorpi ed i diversi reagenti sono caricati dall'alto in aliquote di 100 µl. I reagenti entrano in contatto con la fettina di campione, mentre l'eventuale eccesso viene spinto in basso dal reagente successivo e si deposita sul fondo del contenitore. Ogni contenitore ha una capacità di 10 vetrini ed è provvisto di un coperchio in plastica trasparente. Il contenitore può essere messo in stufa. Il vantaggio di questa metodica è di standardizzare manualmente le reazioni utilizzando solo100 µl di anticorpo.

. 6 - Schema dell'adsorbimento degli anticorpi a una particella di oro colloidale (Inalco - British BioCell International).

celbio
Reagenti per la ricerca immunologica KPL e Cedarlane

celbio rappresenta in Italia due società che hanno una lunga tradizione in campo immunologico: la canadese Cedarlane e la statunitense KPL.
Cedarlane offre un'ampia gamma di anticorpi primari e proteine ricombinanti prodotti in topo, ratto o uomo, antisieri HLA, complemento, anticorpi secondari e coniugati di streptavidina, oltre a una serie di prodotti e immunocolonne per la separazione cellulare.Tra questi ultimi, sono particolarmente innovativi i prodotti Lympholyte per la separazione delle cellule mediante centrifugazione con lo scopo di isolare linfociti vitali da popolazioni di cellule di topo, ratto, coniglio e uomo. Le applicazioni di Lympholyte includono l'isolamento di linfociti vitali da sangue periferico oppure da organi linfoidi (soprattutto dalla milza) e la rimozione delle cellule morte dalle sospensioni di linfociti.
Tra i prodotti KPL disponibili in catalogo rientrano: anticorpi purificati per affinità, marcati e non, substrati stabili, soluzioni e diluenti., immunoreagenti come proteina A e streptavidina marcate
KPL offre anche una serie di servizi specializzati come:
- produzione di anticorpi(mono e policlonali) in capra, coniglio, pollo, pesce, topo,
- purificazione e coniugazione su richiesta del cliente (attacco di enzimi e fluorocromi ad anticorpi e di proteine carrier ad apteni)
- sviluppo di saggi utilizzando saggi del cliente o commerciali, tra cui ELISA in micropiastra, blotting su membrana, saggi immunoistochimici
Tra i sistemi di rivelazione enzimatica citiamo il LumiGLO, un substrato chemiluminescente a base di luminolo per la rapida rivelazione di sonde o anticorpi marcati con HRP in piastre microtiter o immobilizzati su membrana. Con il substrato LumiGLO, che fornisce una maggiore sensibilità di quella offerta dagli anticorpi marcati con 125I o dai substrati colorimetrici, i blot possono essere esposti ai raggi X o a pellicole Polaroid ad alta velocità per una registrazione permanente dei risultati



. 7 - Nuovo reagente di purificazione/separazione di anticorpi CBD-proteina A (Sigma).
Il Il Cellulose Binding Domain (CBD) è stato geneticamente legato alla proteina A ricombinante in modo da creare un ligando bivalente, la proteina di fusione CBD-proteina A. Una estremità è capace di legarsi a una matrice di cellulosa, mentre l'altra estremità lega gli anticorpi. la proteina di fusione può essere utilizzata per purificare anticorpi legandoli a beads di cellulosa o membrane di nitrocellulosa .

. 8 - Schema di funzionamento del kit completo per saggi EIA sandwich su micropiastra per la rivelazione di di HTLV-I, II (Astra - Immunotech).
Il kit contiene piastre microtitolo rivestite di anticorpo specifico e tutti i reagenti necessari per completare la reazione: anticorpo secondario biotinilato, streptavidina coniugata a perossidasi, il substrato TMB con relativa soluzione stop.

. 9 - Diversi substrati per la rivelazione in immunoblotting di anticorpi marcati con enzimi (Celbio - KPL).
Si tratta di Western Blots di lisati virali di HIV-l elettroblottati su membrana di nitrocellulosa. L'immunorivelazione con siero umano positico per HIV è stat seguita dall'aggiunta di un anticorpo marcato con un enzima e rivelata con il substrato adatto.

. 10 - HIV Western blot sviluppato utilizzando il substrato chemiluminescente LumiGLO (Celbio - KPL)

. 11 - Esempio di immunostaining con il kit 'universale' OmniTags Plus (Genzyme - Shandon Lipshaw)
Nel caso rafurato, l'immunostaining è stato ottenuto utizzando il substrato DAB che produce una colorazione marrone facilmente visibile.

Astra
Via Ciro Menotti 1/A
20129 Milano
Tel. 02/745565
Fax 02/747014

Bio-Optica Milano
Via S.Faustino 58
20134 Milano
Tel. 02/2640274
Fax 02/2153000

BioSPA-Soc. Prod. Antibiotici
Via Biella 8
20143 Milano
Tel. 02/891391
Fax 02/8132983

Celbio
Via ino 20/22
20016 Pero (MI)
Tel. 02/381951
Fax 02/38101465
(vedi scheda)

Genzyme
Via Cesare Cantù 11
20092 Cinisello Balsamo (MI)
Tel. 02/6127621
Fax 02/66011923
(vedi scheda)

Histo-Line Laboratories
Viale Montenero 66
20135 Milano
Tel. 02/55012627
Fax 02/55012636

ICN Biomedicals
Via Lambro 23/25
20090 Opera (MI)
Tel. 02/57601041
Fax 02/57601610

Inalco Spa - Div. Labo
Via Calabiana 18
20139 Milano
Tel. 02/55213005
Fax 02/5694518

Italscientifica
Via Assarotti 5/6
16121 Genova
Tel. 010/8318901
Fax 010/8398808
(vedi scheda)

Poiesys
Via T. Aspetti 38
35132 Padova
Tel. 049/8643339
Fax 049/8643441

Prodotti Gianni
Via Quintiliano 30
20138 Milano
Tel. 02/5097746
Fax 02/5097358

Sigma Aldrich
Via Gallarate 154
20151 Milano
Tel. 02/33417730
Fax 02/38010737

Space Import-Export
Via Minturno 9
20127 Milano
Tel. 02/2575377
Fax 02/2572231

 Immunofluorescence Method

The purpose of immunofluorescence is to detect the location and relative abundance of any protein for which you have an antibody. Once you have antibodies to your favorite protein, you can use them to indicate where the protein is located. In this example, we will use antibodies for the calcium ATPase, or pump, that is located in the endoplasmic reticulum (ER) of very cell. The antibody used here only recognized the chicken calcium ATPase but immunofluorescence can be used on any protein.

The key to this entire process is the ability to visualize the antibody when looking through a microscope. Since antibodies are smaller than calcium ATPases, you cannot see the antibody directly. Therefore, you have to use a fluorescent dye that is covalently attached to the antibody. When a light illuminates the fluorescent dye, it absorbs the light an emits a different color light which is visible to the investigator and can be photographed.

ure 1. In most immunofluorescence experiments, two antibodies are employed. The first one, called the primary antibody, is typically generated in a mouse and binds to your favorite protein, which in this case is the chicken calcium ATPase (shown as a series undulating striped line that zigzags through teh ER membrane 10 times). The secondary antibody was purchased from a company that sells antibodies that bind to mouse antibodies and have a fluorescent dye covalently attached to it. As illustrated here, the secondary antibodies can bind to multiple sites on the primary antibody and thus produce a brighter signal since more dyes are brought to a single location.

The first step is to choose your cells of interest. In this case, we will look at a chicken fibroblast, or skin cell. It was grown in tissue culture and so it appears as an isolated cell witn no visible neighbors.

The cell was fixed with formaldehyde to retain the shape and location of all cellular proteins. The cell was treated with a mild detergent to disolve small holes in the membranes so the antibodies could have access to the cytoplasm. Because the calcium ATPase is located in the ER, the antibodies must have access to the cytoplasm or they could not bind to the target protein.

ure 2. This immunofluorescence micrograph shows the ER being labeled with a monoclonal antibody against the the chicken calcium ATPase. This chicken cell was fixed, permeablilized, and processed for immunofluorescence. White indicates the location of the fluorescent antibody and thus the calcium ATPase to which the antibody was bound. Immunofluorescence photomicrograph by A. Malcolm Campbell.

Using immunofluorescence, investigators can see when, where and how much of their favorite protein is expressed in any cell or tissue. On this web e, you can see other examples where the same antibody was used to labled chicken calcium ATPase in other chicken tissues.

Antibodies are an important tool for demonstrating both the presence and the subcellular localization of an antigen. Cell staining is a very versatile technique and, if the antigen is highly localized, can detect as few as a thousand antigen molecules in a cell. In some circumstances, cell staining may also be used to determine the approximate concentration of an antigen, especially by an image analyzer. Cell staining can be divided into four steps: cell preparation, fixation, application of antibody, and evaluation.

As a first step, cells to be stained are attached to a solid support to allow easy handling in subsequent procedures. This can be achieved by several methods: adherent cells may be grown on microscope slides, coverslips, or an optically suitable plastic support. Suspension cells can be centrifuged onto glass slides, bound to solid support using chemical linkers, or in some cases handled in suspension.

The second step is to fix and permeabilize the cells, to ensure free access of the antibody to its antigen. Perfect fixation would immobilize the antigens, while retaining authentic cellular and subcellular architecture and permitting unhindered access of antibodies to all cells and subcellular tments. Wide ranges of fixatives are commonly used, and the correct choice of method will depend on the nature of the antigen being examined and on the properties of the antibody used. Fixation methods fall generally into two classes: organic solvents and cross-linking reagents. Organic solvents such as alcohols and acetone remove lipids and dehydrate the cells, while precipitating the proteins on the cellular architecture. Cross-linking reagents (such as paraformaldehyde) form intermolecular bridges, normally through free amino groups, thus creating a network of linked antigens. Cross-linkers preserve cell structure better than organic solvents, but may reduce the antigenicity of some cell components, and require the addition of a permeabilization step, to allow access of the antibody to the specimen. Fixation with both methods may denature protein antigens, and for this reason, antibodies prepared against denatured proteins may be more useful for cell staining. Four different fixation methods are described. The appropriate fixation method should be chosen according to the relevant application.

The third step of cell staining involves incubation of cell preparations with antibody. Unbound antibody is removed by washing, and the bound antibody is detected either directly (if the primary antibody is labeled) or, indirectly using a fluorochrome-labeled secondary reagent. (See Fluorescent Dye Properties)

In the fourth and final step, the staining is evaluated using fluorescence microscopy.



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