Il genere Streptococcus appartiene alla famiglia delle Streptoccocaceae alla quale fanno parte anche Pedicoccus, Leuconostac, Aerococcus e Gemella. A sua volta il genere Streptococcus si divide in: S.Piogeni S.Viridans S.Lattici e S.Fecali o Enterococchi.

In generale gli Steptococchi sono batteri Gram negativi, di forma coccoidale, disposti a catenella, immobili, con metabolismo fermentativo, aerobi/ anaerobi facoltativi, hanno una temperatura di crescita che va dai 10 ai 40 °C ( ottimale 37°C ) sono omofermentativi, ossia producono acido lattico, e si distinguono dalle Micrococcaceae poiché hanno catalasi negativa e sono acromogeni. Hanno esigenze nutrizionali piuttosto complesse e sono estremamente diffusi sulle mucose dell' uomo e degli animali. I generi patogeni possono provocare malattie gravi come i Piogeni che provocano la mastite agli animali e gli Enterococchi che sono indice di inquinamento fecale.

La classificazione degli Streptococchi in specie patogene e non, si basa sull' attività emolitica e sullo studio dei caratteri fisiologici attraverso le prove di Sherman.

L' Attività Emolitica degli Streptococchi consiste nella loro capacità di rompere o meno i globuli rossi e tale capacità è messa in evidenza su piastre di Agar sangue.

Possono pertanto essere:

Alfa emolitici ( S. Viridans e S.Fecali ) presentano cioè una emolisi parziale, le colonie sono circondate da un alone di colore verdastro dovuto a tale trasformazione dell'emoglobina, ossia del pigmento contenuto nei globuli rossi, che ha la funzione di trasportare ossigeno e anidride carbonica nel sangue.

Beta emolitici ( S. Fecali e S. Piogeni ) presentano cioè una emolisi totale della emoglobina e le colonie sono circondate da un alone chiaro.

Gamma emolitici ( S.Lattici e S.Fecali ) emolisi nulla, cioè non danno origine ad alcuna trasformazione della emoglobina, pertanto non si ha nessun alone intorno alle colonie.

Le Prove Di Sherman consistono nello studio dei caratteri fisiologici dei microrganismi ricercati, attraverso trattamenti termici ossia ponendo i microrganismi a diverse temperature di crescita: 45°C 10°C e 37°C ( in ambiente salino con presenza del 6.5% di NaCl a pH di 9.6 per verificare se sono alofili: S. Fecali ) per poi poterli classificare:

[ disegnare una tabella con le vari divisioni a seconda della temperatura di crescita ]

I più patogeni fra tutti sono i Piogeni la cui virulenza è dovuta alla loro formazione di tossine e particolari enzimi tossici, essi hanno una crescita negativa sia a 45°C sia a 10°C.

Gli Streptococchi Fecali fanno parte della flora microbica intestinale e per questo sono indice di inquinamento di tipo fecale. Per questo motivo la loro presenza in alimenti indica una cattiva igiene di lavorazione e  possono pertanto provocare infezioni all' organismo.

Gli Streptococchi Lattici non sono patogeni anzi, la loro presenza negli alimenti come i derivati del latte ( yogurt e formaggi ) è fondamentale.

Gli Streptococchi Viridans producono aromi per salumi e formaggi.

SCOPO Ricerca del genere Streptococcus in un campione di latte crudo, ossia di latte prodotto da vacche, pecore o capre non sottoposto ad una temperatura superiore ai 40°C.

MATERIALE USATO

Campione di latte crudo

Slanez Bartley

BHI agarizzato e Broth

NaCl

Piastre e provette

Bilancia elettronica

Termostato

Autoclave

Per avere in piastra colonie isolate solo di Streptococcus, si usa come terreno lo Slanez Bartley, la cui componente selettiva è la sodio azide e la colorazione rosso mattone delle colonie da analizzare è data dal Tetrazolio Cloruro.

Ricetta:   Triptosio 20,0 g/l

Estratto di lievito 5,0 g/l

Destrosio 2,0 g/l

Sodio Fosfato Monoacido 4,0 g/l

Tetrazolio Cloruro 0,4 g/l

Sodio Azide 0,1 g/l

Agar 10,0 g/l

42 g : 1000 ml = x g : 120 ml   x g = 5,04 g da pesare

Si pone la quantità di polvere pesata in una beuta e si aggiungono 120 ml di acqua distillata, lo si porta ad ebollizione e lo si lascia a bagnomaria a temperatura di 50°C.

Questo tipo di terreno non va infatti sterilizzato con l' autoclave ma portandolo ad ebollizione o attraverso membrane filtranti.

- Si versano sottocappa circa 15 ml di terreno in ogni piastra ( 8 in tutto ) e si lascia solidificare. Successivamente si passa all' isolamento selettivo, che ha lo scopo di ottenere colonie isolate pure; esso si effettua depositando sul terreno di sole 4 piastre una goccia di latte crudo ( campione ) e stemperando con l'ansa sterile. In altre 2 piastre si semina un ceppo noto di streptococchi, per verificare la qualità del terreno e le restanti 2 piastre non vengono seminate poiché vanno a verificare la sterilità del terreno.

- Si incuba alle diverse temperature per 24 ore:

37°C una piastra col controllo terreno positivo

una piastra col controllo terreno negativo

due piastre seminate

44°C una piastra col controllo terreno positivo

una piastra col controllo terreno negativo

due piastre seminate

Dopo 24 ore di incubazione si verifica la crescita delle colonie rosso mattone, ossia le colonie di streptococchi e successivamente si verifica che le stesse colonie siano effettivamente di streptococchi, osservando le caratteristiche morfologiche di una colonia rossa attraverso l' osservazione dei Gram e facendo una prova della catalasi.

Colorazione dei Gram

Si stempera una parte di colonia cresciuta in piastra, in una goccia di acqua depositata su un vetrino portaoggetti da microscopio. Si distende per strisciamento con su tutta la superficie del vetrino e si lascia asciugare e fissare con veloci passaggi sulla fiamma del bunsen. Si lascia il vetrino nel violetto di genziana per 1 minuto, si toglie l'eccesso di colore con l'acqua e successivamente si passa il vetrino nel Lugol. Si lava nuovamente con acqua e si passa nell'alcool e successivamente nella safranina.

Al microscopio si verifica la colorazione blu degli streptococchi e quindi Gram positivi e anche la morfologia: cocchi disposti a catena.

Prova Della Catalasi

E' una prova enzimatica che si effettua stemperando su un vetrino di orologio una parte di colonia sulla quale è stata eseguita la colorazione dei Gram, si aggiunge acqua ossigenata e si verifica che, avendo gli streptococchi catalasi negativa, non si ha effervescenza, ossia non si ha produzione di ossigeno per la mancanza dell' enzima.

Dopo aver verificato che le colonie siano di streptococchi, si prepara un becco di clarino per il mantenimento della colonia esaminata, usando come terreno il BHI, ossia un terreno generico per batteri esigenti.

Ricetta:  Estratto Di Carne 1,5 g/l

Peptone 10,0 g/l

Glucosio 2,0 g/l

NaCl 5,0 g/l

Sodio Fosfato Monoacido 2,5 g/l

23,5 g : 1000 ml = x g : 20 ml   x g = 0,47 g da pesare di BHI più 1,5% di Agar

- Si pone la quantità pesata in una beuta e si aggiungono 20 ml di acqua distillata,  si scioglie e si pongono 15 ml di terreno in due provette. Si sterilizza a 121°C per 15 minuti e successivamente si lasciano solidificare inclinati.

- Sottocappa si stempera la colonia su cui si sono fatte le precedenti prove, sulla superficie di entrambi i becchi di clarino. S incuba a 37°C per 48 ore.

- Una volta verificata la crescita si esegue nuovamente la colorazione dei Gram e la prova della catalasi, per un ulteriore accertamento.

Prove Di Sherman

Servono per suddividere gli streptococchi nei 4 gruppi: Viridans, Piogeni, Fecali e Lattici.

Sono prove di carattere fisiologico e che si eseguono a 3 diverse temperature.

Si utilizza come terreno il BHI Broth, senza l'aggiunta quindi di Agar.

37 g : 1000 ml = x g = 70 ml   x g = 2,59 d da pesare

- Si pone la quantità pesata in una beuta e si aggiungono 70 ml di acqua distillata,  si scioglie e si pongono 10 ml di terreno in tutte le 6 provette, due delle quali presentano 6.5% di Nacl per vedere se sono alofili. Si sterilizza 121°C per 15 minuti.

- Si semina prelevando una colonia dal becco di clarino con l'ansa sterile.

- Si incuba a 3 diverse temperature: due provette a 45°C, due provette a 10°C e le due provette con NaCl a 37%C.

- Dopo 24 ore di incubazione, si ritengono positive quelle con sedimento bianco sul fondo.

Per osservare l'emolisi si prepara una piastra di Columbia Agar

44 g : 1000 ml = x g : 30 ml  x g = 1,32 g da pesare

Si pone la quantità pesata in una beuta e si aggiungono 30 ml di acqua distillata. Si mette a sterilizzare a 121°C  per 15 minuti, si pone in bagnomaria a fine sterilizzazione, ad una temperature di 50°C, si aggiunge 5% di sangue di montone e si versa il terreno in due piastre. Dopo aver fatto solidificare si semina strisciando una colonia del becco di clarino ed una colonia presa dalla piastra fatta all' inizio. Si mette ad incubare a 37°C.

Risultati Ottenuti

Piastre piastre del controllo terreno entrambe negative.

Piastre a 45 e 37°C non inquinate e presentano solo colonie rosso mattone.

Colorazione Dei Gram Gram positivi, forma coccoidale disposti a catenella.

Prova Catalasi Catalasi negativa.

Prove Di Sherman: tutte le sei provette positive.

Attività Emolitica: Gamma emolitici.

Conclusioni

Poiché le prove di Sherman sono risultate tutte positive ( Fecali )e l' emolisi è risultata di tipo gamma ( Fecali ), si può affermare che nel campione di latte crudo, erano presenti ENTEROCOCCHI.